二氧化硫(SO2)熏蒸對葡萄果實結構和花色素苷含量的影響

張 磊,許 靜,魏 佳,張 政,吳 斌,3,*

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農業科學院農產品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆農產品質量安全實驗室,新疆烏魯木齊 830091)

紅地球葡萄(VitisviniferaL. cv Redglobe)果肉脆硬,耐貯藏,果皮中含有豐富的花色素苷[1]。葡萄果梗、果軸表面分布有大量的皮孔和氣孔,而表皮無氣孔,僅有少量皮孔且多栓化,SO2氣體主要通過果梗進入葡萄果實中[2]。

花色素苷(Anthocyanin)屬于黃酮類化合物,是一種存在于植物細胞液泡中的水溶性色素。主要存在于植物的葉片、果實、根、莖、幼苗中,因為具有吸光性通常呈現出紅色、藍色或紫色等顏色。其含量是影響葡萄果皮顏色的主要因素[3-5]。二氧化硫(SO2)氣體熏蒸已經被廣泛應用商業化鮮食葡萄貯運保鮮中,SO2熏蒸能夠延緩葡萄果實衰老,增強貯藏保鮮效果[6]。研究表明SO2處理還能延長無花果[7]、龍眼[8]和荔枝[9]的貯藏期和貨架期壽命。但SO2保鮮劑使用劑量和方式不合適會對葡萄果皮產生漂白作用,造成SO2殘留量超標;還會造成果實衰老、腐敗加速、風味變異等[10]。研究報道適宜濃度的SO2處理可以降低對葡萄果皮花色素苷的褪色作用[11],SO2與葡萄花色素苷的反應在葡萄酒行業中也被廣泛應用[12]。目前對SO2處理葡萄的研究主要集中在貯藏品質,其對鮮食葡萄果皮漂白傷害機理至今還不明確。

本研究以“紅地球”葡萄為試材,分析SO2氣體對葡萄細胞超微結構和果皮褪色的影響,研究花色素苷相關酶活性和基因表達的差異性,從分子生物學方面探討SO2可能的化學和生理作用,為降低SO2對葡萄果皮花色素苷的影響和SO2在商業化貯運中的精準應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅地球葡萄 于2016年10月14日采摘,挑選大小均一、無機械損傷、無病蟲害的葡萄果實,采后當日置于(0±1) ℃實驗室冷庫中進行預冷處理,預冷時間24 h,新疆烏魯木齊三坪農場葡萄種植園;熒光定量試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、TIANScript試劑盒、6×DNA Loading Buffer、Mark D2000、GoldenView 核酸染料天根生化科技有限公司;丙酮、乙二胺四乙酸、乙酸鈉 天津市福晨化學試劑廠;十六烷基三甲基溴化銨、瓊脂糖、Ttis-Base 北京索萊寶科技有限公司;聚乙二醇6000、氯仿、水飽和酚 天津市致遠化學試劑有限公司;硼酸 天津市光復科技發展有限公司;氯化鋰、焦碳酸二乙酯 Sigma公司;戊二醛 天津市盛奧化學試劑有限公司;以上試劑均為國產分析純;二氧化硫(SO2)氣體(純度為99.99%) 廣州世源氣體有限公司。

S-570型掃描電子顯微鏡 日本日立公司;SK7200H超聲波清潔器 上海科導超聲儀器有限公司;LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司;Firereadear-100凝膠成像系統 英國Firereadear公司;DYY-6D核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;Biometra 070-851PCR儀 德國耶拿分析儀器公司;LightcyCler ? 96熒光定量儀 羅氏公司;LDZX-50KBS壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法 將整筐葡萄以品字型碼垛,置于1 m3的熏蒸室內。在前期課題組的研究基礎上,通過濃度篩選,確定了100和500 μL/L SO2濃度最適,故此實驗分別用100和500 μL/L標準SO2氣體熏蒸葡萄2 h(每隔10 d熏蒸一次,共熏蒸11次),以不使用SO2間歇熏蒸處理為對照。熏蒸結束后內襯吸水紙,外套PVC保鮮袋并扎口,在(0±1) ℃和濕度(RH)=95%條件下貯藏100 d。至貯藏結束,每20 d取樣一次(共6次),每次取樣2 kg,每個處理重復3次。由于對照果貯藏至100 d時,果實腐爛現象極為嚴重,無法取樣,故對照果只取樣至80 d。

1.2.2 果梗超微結構的觀察 電鏡樣品的制備參考趙曉敏等[13]的方法,稍有改動。隨機抽取紅地球葡萄,用刀片切5 mm×2 mm稍果皮小塊和5 mm的果梗小段,置于樣品臺上,噴金后在1300倍下觀察果梗氣孔的形態。

1.2.3 果梗氣孔導度的測定 當掃描電鏡拍攝完畢以后,選擇氣孔結構完整清晰電鏡圖,進行果梗導度測定。參考劉龍博等[14]的方法,利用圖像采集系統(MShot Digital Imaging System)拍攝氣孔圖片,并用測微尺和Adobe Photoshop 6.0軟件測出尺寸,再根據比例尺計算實際大小。

1.2.4 果皮花色素苷及其相關酶活性總花色素苷含量的測定 取果肉組織混勻,用液氮研磨儀研成粉末后錫箔紙包裹,于-80 ℃保存進行各項活性指標的測定。花色素苷的測定參照張家榮等[15]的方法;花色素苷酶的測定參照Martino等[16]的方法;苯丙氨解氨酶(PAL)的測定參照曹建康等[17]的方法;4-香豆酸CoA連接酶(4CL)的測定參照杜紅豆[18]的方法。

1.2.5 果皮花色素苷相關基因表達 參照改良的CTAB法[17]進行葡萄果皮RNA的提取,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。采用實時熒光定量PCR方法測定PAL、4CL、DFR和LDOX的表達量。引物采用Primer 5.0軟件設計,序列見表1。以KyActin1為內參,進行PCR反應,反應體系為50 μL,其中包括:8 μL 10×Tap buffer II(Mg2+plus),4 μL dNTP,1.5 μL上游引物,1.5 μL下游引物,4 μL模板cDNA,0.5 μL Taq DNA Polymerase,28.5 μL滅菌超純水。反應采用兩步法,其條件為:94 ℃預變性3 min,94 ℃變性1 min,65 ℃退火30～45 s,共32～35個循環。根據目的基因和KyActin1的閾值循環(Ct),采用2-ΔΔCt法,計算樣品中基因相對表達量。

表1 用于Real-Time PCR 的特異引物設計

1.3 數據處理

使用Sigma Plot 12.0軟件作圖,SPSS 19.5進行數據方差分析并利用Duncan法進行均值比較。p<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SO2熏蒸對紅地球葡萄果梗氣孔導度的影響及其掃描電鏡觀察

氣孔是外界與植物體內氣體進行交換的通道,SO2濃度過高時就會影響氣孔的正常開啟與關閉[20]。由圖1可知,在整個貯藏期間,對照果的氣孔導度呈先下降后上升的變化趨勢。而SO2處理果梗氣孔導度基本呈下降的趨勢。貯藏前期(0～60 d)對照果氣孔導度下降幅度反而大于SO2處理果,但在貯藏第60 d后,對照果氣孔導度開始大幅增加,而SO2處理果氣孔導度開始減小,尤其貯藏至100 d時,對照果氣孔導度分別比100和500 μL/L SO2處理果高了25.53%和30.85%(p<0.05)。這表明,一定濃度SO2處理能夠誘導葡萄貯藏后期果梗氣孔導度的減小。

圖1 不同處理對紅地球葡萄果梗氣孔導度影響

圖2電鏡掃描觀察結果表明,第20 d,果梗氣孔結構和表面均正常(圖A～圖C);第60 d,對照果果梗氣孔導度較大,果梗周圍表面出現小的顆粒狀突起,而SO2處理果果梗氣孔導度減小,保衛細胞突起明顯,形成明顯的環狀的凸起(圖D～圖F)。第100 d,對照果果梗周圍表面破損加重、裂縫增大、失水加速,氣孔結構嚴重受損。而SO2處理果氣孔保衛細胞下陷明顯,100、500 μL/L SO2處理果梗氣孔導度為貯藏期內的最小值(圖G～圖I)。

圖2 不同處理對葡萄果梗氣孔結構的影響(1300×)

2.2 SO2熏蒸對紅地球葡萄花色素苷含量和花色素苷酶的影響

花色素苷(anthocyanin)屬于類黃酮類色素,參與了紅葡萄顏色的形成[21]。花色素苷酶(anthocyanase)能催化花色苷β-糖苷鍵斷裂,使花色苷水解使其褪色[22]。由圖3A可知,貯藏前期(0～80 d)對照果和100 μL/L SO2處理果中花色素苷的含量無顯著差異(p>0.05),但是貯藏至100 d時,對照果已經腐爛,而100和500 μL/L SO2處理果仍能維持花色素苷含量,并且保證葡萄的品質(圖3B)。結果表明,一定濃度SO2處理能夠維持葡萄貯藏后期花色素苷的含量。

圖3 不同處理對紅地球葡萄果皮花色素苷含量(A)以及花色素苷酶活性(B)的影響

2.3 SO2熏蒸對紅地球葡萄PAL和4CL活性的影響

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是花色素苷及其他類黃酮生物合成的直接前體[23]。從圖4A可知,對照果和SO2處理果中PAL活性均呈先上升后下降的趨勢。對照果和500 μL/L SO2處理果PAL活性均顯著低于100μL/L SO2處理果(p<0.05)。這表明100μL/L SO2對PAL活性具有明顯的誘導作用。4-香豆酸CoA連接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)能夠為花色素苷提供豐富的前提物質[24]。由圖4B可知,對照果和100 μL/L SO2處理果4CL活性均呈先上升的趨勢,而500 μL/L SO2處理果呈先上升后下降的趨勢。表明,100 μL/L SO2處理可以促進4CL的活性的增長(p<0.05),500 μL/L SO2處理則會在后期(60～100 d)抑制4CL的活性。

圖4 不同處理對紅地球葡萄果皮PAL(A)和4CL酶(B)活性的影響

2.4 SO2熏蒸對紅地球葡萄PAL、4CL、DFR和LDOX基因相對表達量的影響

PAL基因表達量增加,能為后期花色苷合成提供充足的前體物質[25]。由圖5A可知,第20、40 d,SO2處理果PAL基因相對表達量顯著高于對照果(p<0.05),100 μL/L SO2處理果PAL基因整體轉錄水平高于500 μL/L SO2處理果。由圖5B可知,500 μL/L SO2處理果4CL基因相對表達量在貯藏期間呈先上升后下降的趨勢,在貯藏第40 d時,4CL基因相對表達量達到峰值,而100 μL/L SO2處理果4CL基因相對表達量始終呈現上升的趨勢。第100 d,4CL基因轉錄表達量是貯藏初期的2.75倍(p<0.05)。結果表明,100 μL/L SO2處理促進葡萄PAL和4CL基因表達。

圖5 不同處理對紅地球葡萄果皮PAL(A)、4CL(B)、DFR(C)、LDOX(D)基因相對表達量的影響

二氫黃酮醇4-還原酶(Dihydronavonul 4-reductase,DFR)對花色素苷的最終形成起決定性作用,是一個重要的調控點[26]。由圖5C可知,對照果和SO2處理果DFR基因表達均呈下降的趨勢。除了第20 d外,100 μL/L SO2處理果DFR基因下調趨勢均高于500 μL/L SO2處理果。貯藏至第100 d時,100 μL/L SO2處理果DFR基因表達量僅為500 μL/L SO2處理果的60.6%(p<0.05)。無色花色素雙加氧酶(Leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX)可將無色原花色素催化生成有色花色素,對花青素的合成也至關重要[27]。由圖5D可知,對照果和SO2處理果LDOX基因的表達均經歷逐漸升高后下降的趨勢。第60 d,100 μL/L SO2處理LDOX基因轉錄水平最高(p<0.05)。結果表明,100 μL/L SO2處理可促進葡萄果皮LDOX基因轉錄水平的上調,但抑制了DFR基因的表達。

2.5 葡萄果皮中花色素苷合成相關酶及其基因的相關分析

由表2可知,在貯藏期間,葡萄的果皮中花色素苷的含量與花色素苷合成相關酶的活性和基因表達是相互關聯的,可能與4CL酶的活性與DFR基因的轉錄表達有關系。而果皮花色素苷的含量與果皮的色澤又有一定的關系。

表2 果皮花色素苷含量、花色素苷酶活性及花色素苷合成酶及其基因的相關分析

3 討論與結論

本研究通過超微結構分析表明,較低濃度SO2處理紅地球葡萄,通過刺激保衛細胞,減少了氣孔導度,阻礙部分SO2進入植物,降低SO2對植物的傷害,從而延緩了花色素苷含量的下降。而高濃度SO2可能導致氣孔開閉調節失調,促進SO2氣體進入葡萄果皮,使果皮pH偏酸性,在有機酸的作用下形成亞硫酸氫根,其對花色苷C4親核攻擊生成無色的花色苷亞硫酸鹽復合物[28]。從而促進花色苷降解,導致果皮漂白。

在本研究中100 μL/L SO2可以抑制DFR基因表達,但上調PAL、4CL、LDOX基因的轉錄表達。花色苷的生物合成路徑可以分為兩個階段:第一階段由苯丙氨酸到4-香豆酰CoA,這是許多次生代謝共有的;第二階段由4-香豆酰CoA轉化為各種黃酮類化合物,其生物合成過程受結構基因和調節基因控制[29-31]。100 μL/L SO2處理上調了PAL、4CL基因的表達,這與100 μL/L SO2處理果PAL和4CL活性變化情況一致。該階段PAL、4CL基因的上調表達促進了苯丙烷類的代謝,為后一階段中類黃酮的代謝提供必需的化合物。葡萄中PAL活性與花色素苷的含量呈顯著正相關[32],4CL基因很可能在植物次生代謝網絡中通過影響類黃酮代謝路徑碳流的方向和流速,進而達到調控葡萄果實顏色的變化[33]。可見PAL、4CL基因的上調表達對花色苷的合成有一定的促進作用。DFR是紅蘋果果皮著色所必須的結構基因[34]。文習成[35]發現紅葉桃葉片在秋季時DFR基因的表達水平隨著花色素苷的積累而升高。而本實驗結果表明DFR的轉錄水平與花色苷相關性比較低,推測其原因可能是由于實驗品種、處理方式、溫度差異不同而導致的。LDOX是葡萄花色苷合成中的關鍵酶,能夠催化無色的原花色素氧化生成有色的花翠素[36-37]。隨著貯藏時間的延長,100 μL/L SO2處理果中LDOX的表達水平高于500 μL/L SO2處理果。Kobayashi等[38]研究發現LDOX在紅色葡萄品種成熟的果皮中表達強,而在白色品種上表達弱或不表達。這與100 μL/L SO2處理紅地球葡萄,果皮顏色更深結果相一致。可能是由于LDOX基因的上調表達,促進了果皮花色素苷的合成。PAL、4CL、DFR、LDOX表達的結果共同說明了葡萄果皮花色素苷的合成可能受到了多個基因的協同調控。

綜上所述,100 μL/L SO2熏蒸處理調節了紅地球葡萄果梗氣孔導度,誘導葡萄果皮中花色素苷酶、PAL、4CL活性增強,上調了PAL、4CL、LDOX基因的表達,下調了DFR基因表達,從而減緩葡萄果皮中花色素苷含量的下降,維持色澤。

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