SO2保鮮劑對玫瑰香葡萄灰霉菌的抑制作用

田 靜,薛美昭,儀慧蘭

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

葡萄是一種主要的農業經濟作物,全球年產量達6×107t[1],主要用于鮮食、釀酒、榨汁、曬干等。葡萄是我國的四大水果之一,其中70%以上用于鮮食。而葡萄果實細嫩多汁,易受致病菌侵染而腐爛,特別是在炎熱的收獲季節腐爛更為嚴重,貯藏和轉運期間的保鮮直接影響果實品質,因此,建立安全高效的保鮮技術對鮮食葡萄產業至關重要。

自1925年[2]用SO2熏蒸貯藏葡萄取得顯著效果以來,SO2類保鮮劑就被廣泛應用于鮮食葡萄產業,在果實貯藏、運銷中發揮了重要作用。SO2類保鮮劑可延緩果實生理衰老,抑制病害發生[3]。但是,傳統采用的SO2劑量較高,造成葡萄果實內SO2殘留量較大,對人體健康不利[4-5]。近期有采用化學方法[6]、物理方法[7]以及生物保鮮膜法[8]等貯藏葡萄果實的嘗試,但其保鮮效果均不及SO2,SO2類保鮮劑仍是當前葡萄貯藏期間最為有效的防腐保鮮劑[9]。為降低SO2殘留,研究人員嘗試低劑量、短期或間歇式SO2熏氣等方式保鮮葡萄果實,在新疆紅地球葡萄和無核白葡萄上取得了明顯效果[10-12]。不同品種葡萄對SO2敏感性不同,采后生理亦存在一定差異,需要選擇各自適合的SO2熏氣貯藏方式。

低溫可降低果實生理活動,延緩果實衰老速度,并有效抑制病原菌的發生及危害[13],是常用的保鮮措施之一。適當降低葡萄貯藏溫度,對抑制果實采后生理衰老和病害發生會產生雙重調節作用,目前SO2結合低溫是葡萄采后保鮮最為有效的手段[9,14]。

灰霉菌(Botrytiscinerea)是引起葡萄果實采后腐爛的主要致病菌,其適應性強,在低溫下仍能生長,具有潛伏侵染和低溫致病的特點。為此,本研究以鮮食玫瑰香葡萄(VitisviniferaL.,Muscat Hamburg)為實驗材料,從其表面分離出主要致病菌灰霉菌,研究了模擬貯藏條件下SO2類保鮮劑對灰霉菌孢子萌發和菌絲生長的影響,分析了SO2類保鮮劑的抑菌效應,以期為低硫保鮮技術的建立提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰香葡萄 采自本地葡萄園;灰霉菌 由本實驗室在采后腐爛的葡萄果實上分離純化得到;焦亞硫酸鈉 分析純,天津市天力化學試劑有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉 分析純,北京化工廠;速釋葡萄保鮮紙、控釋葡萄保鮮片 均由山西省農業科學研究院農產品貯藏保鮮研究所提供。

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;LS-50HD型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司;THE-C恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠;303-2電熱培養箱 南通縣金沙自動化儀表廠;GZX-9076MBE電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;SC-350立式冷藏柜 青島海爾特種電冰柜有限公司;DPT2顯微鏡 OLYMPLUS;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;PTM400型SO2氣體分析儀 北京兄弟智達科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰香葡萄的處理及指標測定

1.2.1.1 玫瑰香葡萄預處理 剪除機械損傷果粒,選色度一致的果實置于內襯PE保鮮袋的塑料箱中,按每箱5 kg分裝,于0 ℃預冷12 h后,SO2保鮮組每箱內放1/4張葡萄速釋保鮮紙(含Na2S2O5約1.2 g)和8包葡萄控釋保鮮片(含Na2S2O5約6.8 g),對照組不放藥劑,扎緊塑料袋口,于-1～0 ℃冷庫中貯藏。

1.2.1.2 SO2濃度的測定 采用SO2氣體分析儀,在貯藏期間,0～40 d內每隔5 d測定葡萄保鮮袋內的SO2濃度,之后每隔10 d測定SO2濃度,繪制SO2濃度曲線。

1.2.1.3 葡萄表面pH的測定 采用酸性精密pH試紙,檢測貯藏60 d時葡萄表面水滴的pH。

1.2.1.4 微生物數量與種類的測定 選貯藏60 d的葡萄果穗,從對照組和SO2處理組中各取大小相同、外形完好的葡萄果粒10粒,連同果柄剪下,放入無菌培養皿中,用5 mL無菌水沖洗表面,取沖洗液測量560 nm處的光密度值,并取沖洗液200 μL涂于PDA平板上,25 ℃培養,觀察菌落特征[15]。

1.2.2 離體實驗及指標測定

1.2.2.1 孢子懸浮液的制備 前期課題組從貯藏的玫瑰香葡萄果實上分離并鑒定(生理生化和分子鑒定)了致病菌灰霉菌。從剛長滿灰霉菌的平板上取直徑為5 mm菌餅,移植于新的PDA培養基上,于25 ℃培養5 d后,加少量無菌水沖洗平皿,收集孢子,制成濃度為1×106個孢子/mL的孢子懸浮液。

1.2.2.2 不同pH和時間條件下菌落直徑的測定 選用300、600 mg/L的焦亞硫酸鈉溶液測試抑菌效果。參照貯藏期間葡萄果實表面pH[16],用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液模擬葡萄表面酸性環境,配制pH3.00和pH4.00的焦亞硫酸鈉溶液。用pH3.00和pH4.00、濃度為300 mg/L和600 mg/L的焦亞硫酸鈉溶液于25 ℃、150 r/min孵育灰霉菌孢子(孢子濃度為0.5×106個/mL)1、3、5 h,對照組用相同pH、不含焦亞硫酸鈉的緩沖液孵育孢子。孵育結束后,取孢子懸液5 μL接種于PDA平板中央,置于25 ℃培養,觀察48 h內菌絲生長情況,測量菌絲直徑。

1.2.2.3 不同溫度條件下菌落直徑的測定 用pH3.00濃度為300、600 mg/L的焦亞硫酸鈉溶液于25 ℃、150 r/min孵育孢子1 h,對照組采用相同pH、不含焦亞硫酸鈉的緩沖液孵育孢子。孵育結束后,取孢子懸液5 μL接種于PDA培養基中央,分別于25 ℃和4 ℃培養,觀察和測量菌絲直徑。

1.2.2.4 不同焦亞硫酸鈉濃度及溫度條件下孢子萌發情況的測定 用pH4.00濃度為0、300、600 mg/L的焦亞硫酸鈉溶液于25 ℃孵育1 h的孢子10 μL,于PDA培養基(2 cm×2 cm,厚2 mm)上涂布均勻,于25 ℃和4 ℃培養,并在顯微鏡下(40×)每隔6 h觀察記錄孢子形態及萌發情況,以芽管長度≥孢子短半徑視為萌發,每組觀察500個孢子,每個處理設2個平行,并記錄各組孢子最大萌發率及所需時間。最大萌發率(%)=萌發的孢子數/孢子總數×100。

1.3 數據統計分析

各組實驗數據均來自3次獨立的重復實驗。采用SPSS 21.0進行數據處理分析,用鄧肯氏多重比較方法進行不同處理組之間的差異顯著性檢驗,不同字母代表差異顯著(p<0.05),相同字母表示差異不顯著。利用Excel 2007軟件進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 SO2熏氣濃度及對葡萄表面pH和微生物數量的影響

圖1 貯藏期間SO2濃度及葡萄表面pH變化

2.1.2 SO2對葡萄果實表面微生物的影響 由圖2可知,貯藏60 d后對照組(好果率低于75%[17])果實表面可培養微生物種群和數量顯著(p<0.05)多于SO2保鮮組。分離純化培養后,經菌落形態和回接實驗結果分析,灰霉菌為其中的優勢菌群(圖2A,C)。SO2保鮮組(好果率大于95%[17])果實表面微生物總量很少(圖2C),可培養的微生物的數量和種類均較少,且未發現灰霉菌(圖2B)。

圖2 SO2對玫瑰香葡萄果實表面菌數/菌群的影響

2.2 焦亞硫酸鈉抑菌效應及影響因素

2.2.1 pH和時間對灰霉菌菌落直徑的影響 由圖3可知,25 ℃條件下,以焦亞硫酸鈉處理孢子3 h為例,在pH4.00、300 mg/L焦亞硫酸鈉處理中致病菌生長不能完全抑制,焦亞硫酸鈉濃度提高至600 mg/L時可完全抑制病菌生長,600 mg/L的抑菌強度大于300 mg/L,而pH3.00的300 mg/L焦亞硫酸鈉可完全抑制病菌生長。由此可見,在相同溫度及處理時間下,對于SO2處理組，降低環境pH,可顯著提高低劑量焦亞硫酸鈉的抑菌效力,對抑菌有積極作用(p<0.05)。

由圖3可知,25 ℃條件下,以pH4.00、300 mg/L焦亞硫酸鈉處理組為例,作用孢子1 h,與對照組相比,抑菌效果差異顯著(p<0.05);作用孢子3 h,菌絲生長緩慢,培養36 h才出現菌絲,與對照組差異顯著(p<0.05);作用孢子5 h,處理組完全抑制病菌菌絲生長,與對照組差異顯著(p<0.05)。結果表明,在相同溫度及pH條件下,焦亞硫酸鈉孵育孢子時間越長,抑制效果越明顯,即焦亞硫酸鈉對灰霉菌的抑制作用具有時間依賴性。

由圖3可知,pH4.00焦亞硫酸鈉處理組在25 ℃培養條件下的菌絲直徑顯著大于pH3.00組(p<0.05),說明適當降低pH能夠顯著增強SO2類保鮮劑的抑菌效果。焦亞硫酸鈉高劑量短時間處理與低劑量長時間處理可達到相同的抑菌效果,一定條件下焦亞硫酸鈉可以完全抑制灰霉菌的發生。

圖3 pH和時間對灰霉菌菌絲生長的影響

2.2.2 溫度對灰霉菌菌落直徑的影響 比較圖4A和圖4B可知,pH3.00、300 mg/L焦亞硫酸鈉處理組作用孢子1 h,4 ℃培養下菌絲直徑顯著(p<0.05)小于25 ℃時。4 ℃條件下處理組45 d內平板上無可見菌絲,差異顯著(p<0.05),說明孢子萌發被完全抑制。結果表明,降低環境溫度可顯著提高焦亞硫酸鈉的抑菌效力,焦亞硫酸鈉處理結合低溫貯藏可顯著提高抑菌效果,其中對孢子萌發的抑制在灰霉菌控制中發揮了決定性作用。

圖4 溫度對灰霉菌菌絲生長的影響

2.2.3 焦亞硫酸鈉濃度及溫度對灰霉菌孢子萌發的影響 顯微鏡下對照組孢子大小均一,呈規則的圓形或橢圓形,焦亞硫酸鈉處理組孢子大小不一,有棱角,形態不規則(圖5),說明焦亞硫酸鈉對灰霉菌的孢子產生了毒害作用,破壞了孢子形態,影響了孢子活力,致使孢子不萌發或遲萌發,并對菌絲生長產生抑制。

圖5 焦亞硫酸鈉對灰霉菌孢子形態的影響

檢測焦亞硫酸鈉對孢子萌發的影響發現,用pH4.00、濃度為0、300、600 mg/L的焦亞硫酸鈉孵育灰霉菌孢子1 h后平板培養,25 ℃條件下,分別培養6.25、12、31 h后,達到最大萌發率分別為100%、24%和11%;4 ℃條件下,分別培養54、312、432 h后,達到最大萌發率分別為92%、13%和6%。焦亞硫酸鈉處理組的孢子最大萌發率與對照組間存在顯著差異(p<0.05),萌發率降低76%～89%,但300 mg/L與600 mg/L焦亞硫酸鈉組間僅相差7%～13%。結果表明,降低溫度可使灰霉菌孢子延遲萌發或不萌發,結合低溫貯藏,較低濃度焦亞硫酸鈉處理組可有效抑制灰霉菌孢子的萌發。

表1 焦亞硫酸鈉對灰霉菌孢子最大萌發率的影響

3 結論與討論

本研究以玫瑰香葡萄為實驗材料,從果皮中分離出其貯藏期間主要的致病菌灰霉菌,證實SO2保鮮過程與其抑制果實表面微生物活性和防止致病菌產生有直接關系。進而研究了不同pH、作用時間以及溫度條件下焦亞硫酸鈉對灰霉菌抑菌效果的影響。體外實驗發現,焦亞硫酸鈉處理組灰霉菌孢子萌發率和菌落直徑均顯著低于對照組(p<0.05),抑菌效應與作用時間、pH和溫度直接相關。隨著焦亞硫酸鈉濃度升高,作用時間延長,抑菌作用顯著增強(p<0.05)。降低環境pH并結合低溫貯藏,可增強低濃度焦亞硫酸鈉的抑菌效力。本研究中用pH3.00的焦亞硫酸鈉300 mg/L處理菌孢子后在冷藏溫度下灰霉菌不能萌發和生長。因此,為降低果實中硫殘留,可選擇較低濃度保鮮劑與適當的貯藏溫度、pH環境匹配組合以實現對鮮食葡萄的貯藏保鮮。

SO2、過氧化氫、臭氧等均能抑菌殺菌,但過氧化氫、臭氧對葡萄的保鮮效果遠不及SO2[9]。SO2類保鮮劑作為目前最有效的葡萄果實采后保鮮劑,其保鮮作用可能還與其能誘導果實組織產生抗性有關[22],具體保鮮機制有待進一步研究。為降低果實中的硫殘留,采用較低pH,低劑量SO2短期處理結合低溫條件來貯藏葡萄果實不失為一種良策。本文的研究結果為葡萄保鮮實踐提供了一定的理論基礎。

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