牛磺酸對(duì)大鼠的減重降脂作用

趙玉星,曹雪蓮,郭俊霞,張 靜,張艷貞,陳 文

(北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院食品科學(xué)系,北京 100023)

《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告(2015)》指出,由于膳食結(jié)構(gòu)的變化,全國(guó)18歲及以上成人超重率為30.1%,肥胖率為11.9%,我國(guó)居民超重肥胖問(wèn)題凸顯。而十幾年前的“中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查”也顯示我國(guó)成人血脂異常患病率為18.6%,其中高膽固醇血癥2.9%,另有3.9%的人血膽固醇邊緣升高[1]。肥胖、高脂血癥是導(dǎo)致高血壓、冠心病等疾病的重要因素。臨床實(shí)驗(yàn)表明血清總膽固醇及其酯化顯著增加了冠心病與猝死的風(fēng)險(xiǎn)[2],而降低血脂可以降低冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生率。近幾年來(lái),不斷有報(bào)道表明生活中通過(guò)飲食降膽固醇的可能性與重要性[3]。美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)和美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃專家委員會(huì)制定了家族性高膽固醇血癥管理建議,將飲食結(jié)構(gòu)與生活方式的改善列為首條[4]。因此,探究食品中具有減重降脂作用的活性物質(zhì)具有重要意義。

牛磺酸是一種小分子含硫氨基酸,常見(jiàn)于食物中尤其海產(chǎn)品中,具有廣泛的生物學(xué)功能。有研究報(bào)道給予高膽固醇血癥大鼠3%～5%牛磺酸膳食可顯著降低大鼠血清和肝臟TC水平[5];Mesallamy HOE等[6]給予糖尿病大鼠連續(xù)35 d腹腔注射300 mg/(kg·day)牛磺酸時(shí),大鼠血清和肝臟TC水平顯著降低(p<0.05)。也有臨床研究顯示牛磺酸可以抑制高脂飲食引起的動(dòng)脈粥樣硬化的形成[7],且隨著牛磺酸濃度的增加,抗動(dòng)脈粥樣硬化作用增強(qiáng),可降低心腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8-10]。還有秀麗隱桿線蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)顯示,牛磺酸使線蟲(chóng)的移動(dòng)性增加、脂肪蓄積減少[11]。但關(guān)于牛磺酸減重的研究報(bào)道較少。

到目前為止,大多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是在飼料中添加牛磺酸來(lái)研究其保健功效。鑒于牛磺酸無(wú)色無(wú)味又易溶于水,因此,本文旨在通過(guò)長(zhǎng)期給予高脂膳食大鼠牛磺酸飲水來(lái)探討牛磺酸對(duì)大鼠脂代謝的影響,為研發(fā)牛磺酸改善脂代謝相關(guān)的保健食品和特殊醫(yī)學(xué)用途食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)SD雄性大鼠(許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001,合格證號(hào)11400700147609) 體重90～110 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供;牛磺酸 武漢永安康健藥業(yè)有限公司;飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司,按照國(guó)標(biāo)GB14924.3-2010配制而成,京飼證(2014)06054,其中高脂飼料配方為:78.8%基礎(chǔ)料(維持料),1%膽固醇,10%蛋黃粉,10%豬油,0.2%膽鹽；總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)測(cè)定試劑盒 浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司;游離脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、總膽汁酸(total bile acid,TBA)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

TL2010S高通量組織研磨儀、HWS24型電熱恒溫水浴鍋、MC22-R臺(tái)式微量高速微量冷凍離心機(jī) 北京鼎昊源科技有限公司;WFZ UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;MQX200酶標(biāo)儀 香港Gene Company Limited;FD-1C-50冷凍干燥機(jī) 北京醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng) 成年SD大鼠42只,飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房,遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范要求。實(shí)驗(yàn)前在室溫(22±2) ℃,相對(duì)濕度為40%～55%,12:12 h明暗交替,自由飲水和取食的環(huán)境下適應(yīng)7 d后,根據(jù)血清TC和體重隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、高脂模型組為每組10只,牛磺酸低/高劑量組為每組11只。對(duì)照組和高脂模型組大鼠正常飲水,牛磺酸組大鼠飲用水中分別添加0.5%和1%牛磺酸分別作為低/高劑量組,飼養(yǎng)8周后,牛磺酸低/高劑量組的血清TC值與高脂模型組的相比均無(wú)顯著降低,可能與給予的牛磺酸濃度偏低有關(guān),因此將低、高劑量組的牛磺酸濃度分別提高到2.5%和5%,繼續(xù)飼養(yǎng)4周。每周稱兩次體重,配制兩次牛磺酸水溶液。

1.2.2 樣品收集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前72 h收集糞便,-20 ℃冷凍保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食12 h,稱體重,10%水合氯醛麻醉(4.5 mL/kg體重),股動(dòng)脈采血處死。

按常規(guī)方法:取全血10 μL置于裝有990 μL雙蒸水的玻璃試管中測(cè)定GSH-PX酶活力;制備血清,-20 ℃存放;取肝臟,于-80 ℃保存;取附睪脂肪墊,稱重。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 附睪脂肪墊指數(shù)的測(cè)定 根據(jù)大鼠體重和附睪脂肪墊重計(jì)算附睪脂肪墊指數(shù)。

附睪脂肪墊指數(shù)=附睪脂肪墊重/大鼠體重

1.2.3.2 血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū),測(cè)定血清TC、HDL-C、LDL-C和TG含量以及SOD和 GSH-PX酶活力。

1.2.3.3 肝臟脂質(zhì)測(cè)定 肝組織勻漿液的制備:準(zhǔn)確稱取大鼠肝組織按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9加入勻漿介質(zhì)(三氯甲烷∶甲醇=2∶1),組織研磨儀機(jī)械勻漿,勻漿參數(shù)1950 r/min,60 s/次,3次循環(huán),每次間隔5 s。

將制備好的肝組織勻漿液過(guò)濾,氮吹儀吹干后溶解于6 mL含10% TritonX-100的異丙醇[12],然后取10 μL,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TC和TG濃度。

將制備好的肝組織勻漿液離心(3000 r/min,15 min),取100 μL下層有機(jī)相,氮吹儀吹干后溶解于100 μL含10% TritonX-100的異丙醇,漩渦振蕩混勻,然后取8 μL,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)濃度。

1.2.3.4 糞便TBA測(cè)定 大鼠糞便-20 ℃冷凍48 h以上,冷凍干燥,稱重研磨[13]。取粉末0.5 g左右,加入10倍體積的無(wú)水乙醇,浸提過(guò)夜離心(2500 r/min,10 min)得到上清液,稀釋30倍,取30 μL按照TBA測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.5 還原型GSH、GSH-PX和肝糖原的測(cè)定 按照說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)確稱取大鼠肝臟組織,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9加入勻漿介質(zhì)(PBS緩沖液),組織研磨儀機(jī)械勻漿,勻漿參數(shù)1950 r/min,60 s/次,3次循環(huán),每次間隔5 s。制備好的10%勻漿液離心(3000 r/min,15 min),取適量上清,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH-PX、還原型GSH及樣本蛋白濃度。

肝糖原測(cè)定參照《功能食品功效評(píng)價(jià)原理與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法》[14]中肝糖原測(cè)定一節(jié)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 牛磺酸對(duì)大鼠體重和附睪脂肪墊指數(shù)的影響

采用飲水方式給予大鼠牛磺酸,對(duì)大鼠的飲水量進(jìn)行了監(jiān)測(cè),結(jié)果表明，各組大鼠間的飲水量并無(wú)顯著性差異。由表1,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)后模型組大鼠體重增加明顯,各組大鼠在飼喂期間體重穩(wěn)步增長(zhǎng)。由圖1可知,第4周開(kāi)始模型組大鼠體重已顯著高于對(duì)照組(p<0.05),表示肥胖模型建立成功。飼養(yǎng)8周時(shí),高脂模型組與牛磺酸(低、高)劑量組的血清TC均無(wú)顯著差異。推測(cè)可能與牛磺酸濃度偏低有關(guān),所以增加飲水中牛磺酸濃度,牛磺酸低劑量組由0.5%提高到2.5%,牛磺酸高劑量組由1%提高到5%,繼續(xù)飼養(yǎng)4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與模型組相比,低高劑量牛磺酸均降低實(shí)驗(yàn)期間大鼠體重的增加量,并且高劑量牛磺酸組大鼠體重顯著降低(p<0.05)。研究表明，牛磺酸飲水可以降低高脂飲食大鼠的體重。

表1 牛磺酸對(duì)大鼠體重和附睪脂肪墊指數(shù)的影響

圖1 牛磺酸對(duì)大鼠體重的影響

由表1附睪脂肪墊重和附睪脂肪墊指數(shù)結(jié)果可知,與對(duì)照組相比,模型組大鼠附睪脂肪墊重及附睪脂肪墊指數(shù)均顯著升高(p<0.05),升高幅度分別為62.1%、40.0%;與模型組相比,牛磺酸低劑量組均有所降低但無(wú)顯著差異(p>0.05),牛磺酸高劑量組均顯著降低(p<0.05),降低幅度分別為34.8%、23.8%。結(jié)果表明，牛磺酸飲水有降低大鼠附睪脂肪墊指數(shù)的作用,低劑量組可能由于牛磺酸濃度低而未出現(xiàn)顯著性差異。

2.2 牛磺酸對(duì)大鼠脂質(zhì)的影響

由表2血清的測(cè)定結(jié)果可知,與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清TC和LDL-C顯著升高(p<0.05),上升幅度分別為30.0%和77.1%,表示高膽固醇模型建立成功;與模型組相比,牛磺酸低劑量組血清TC和LDL-C有所降低但無(wú)顯著差異(p<0.05),牛磺酸高劑量組血清TC和LDL-C均顯著降低(p<0.05);而各組之間的HDL-C和TG均無(wú)顯著變化。以上結(jié)果表明,牛磺酸高劑量組可以降低高脂飲食引起的大鼠血清TC水平,主要是通過(guò)降低LDL-C水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的,而各組血清TG無(wú)顯著變化可能與解剖前斷食時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)系。血清TG水平受飲食情況的影響較大,目前我國(guó)保健食品輔助降血脂功能評(píng)價(jià)中已采用實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)不禁食采血檢測(cè)大鼠血清TG的方式。

表2 牛磺酸對(duì)大鼠脂質(zhì)的影響

由表2肝臟的測(cè)定結(jié)果可知,與對(duì)照組相比,模型組大鼠的肝臟TC、TG和FFA含量均顯著增多(p<0.05),表明高脂模型建立成功;與模型組相比,兩個(gè)牛磺酸劑量組肝臟TC、TG和牛磺酸低劑量組的FFA均無(wú)顯著差異,但牛磺酸高劑量組的肝臟FFA含量顯著降低(p<0.05)。以上說(shuō)明,高脂飲食會(huì)引起大鼠肝臟脂質(zhì)堆積,高劑量的牛磺酸可顯著降低肝臟FFA含量(p<0.05)。

2.3 牛磺酸對(duì)大鼠糞便TBA的影響

由表3可知,與對(duì)照組相比,模型組大鼠糞便TBA含量顯著升高(p<0.05);與模型組相比,兩個(gè)牛磺酸劑量組糞便TBA均顯著增多(p<0.05),分別升高了20.2%和31.0%。以上說(shuō)明,牛磺酸雖未顯著降低肝臟TC水平,但明顯增加了糞便TBA的排出,由此可得，牛磺酸飲水促進(jìn)了膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸并隨糞便排出。

表3 牛磺酸對(duì)大鼠糞便TBA的影響

2.4 牛磺酸對(duì)大鼠抗氧化指標(biāo)和肝糖原的影響

由表4可知,與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清GSH-PX無(wú)顯著變化(p<0.05),肝臟GSH-PX活力、還原型GSH含量顯著下降(p<0.05),肝糖原水平顯著升高(p<0.05);與模型組相比,兩個(gè)牛磺酸劑量組血清/肝臟GSH-PX及肝臟還原型GSH均顯著升高(p<0.05),肝糖原顯著降低(p<0.05);各組大鼠血清SOD無(wú)顯著差異(p<0.05)。以上結(jié)果表明,牛磺酸飲水可降低因高脂膳食引起的肝糖原增多,且通過(guò)提高還原型GSH和GSH-PX活性對(duì)機(jī)體氧化損傷起到保護(hù)作用。

表4 牛磺酸對(duì)大鼠抗氧化指標(biāo)和肝糖原的影響

3 討論

關(guān)于牛磺酸降脂的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,主要是將牛磺酸添加于飼料中給予動(dòng)物,也有添加于飲水或以腹腔注射方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并且大多報(bào)道顯示攝入牛磺酸1～4周即可有效降脂[5]。本文采用長(zhǎng)時(shí)間飲水方式探討牛磺酸對(duì)大鼠減重降脂功效。實(shí)驗(yàn)中定期監(jiān)測(cè)了大鼠的飲水量,結(jié)果表明各組大鼠間的飲水量并無(wú)顯著性差異,表明牛磺酸對(duì)大鼠的飲水量并無(wú)影響。

到目前為止,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查顯示牛磺酸影響膽固醇代謝[15-18]。楊燕等[19]的研究表明牛磺酸可以降低大鼠血清TC、LDL-C水平;Chen、Chang等[20-21]的研究中,牛磺酸可以降低小鼠/倉(cāng)鼠肝臟中TC含量;王永輝等[22]的研究中,飼料中添加3%和5%牛磺酸可使大鼠血清TG、TC、LDL-C以及肝臟TC、TG均顯著低于高脂模型組,血清HDL-C水平顯著高于模型組,但添加1%牛磺酸未顯示降脂作用。本實(shí)驗(yàn)中,高劑量牛磺酸使大鼠血清TC、LDL-C顯著降低,這與以往研究報(bào)道一致,但兩個(gè)牛磺酸劑量組血清TG及肝臟TC/TG與模型組未出現(xiàn)差異,可能是由于用高脂膳食飼喂大鼠長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月,大鼠體內(nèi)脂質(zhì)累積過(guò)多,而初始階段牛磺酸濃度都不高,導(dǎo)致牛磺酸未能顯現(xiàn)出有效的降脂效果,血清TG未出現(xiàn)顯著性差異也可能與解剖前斷食時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)系。肝臟內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸排出體外是膽固醇代謝的一個(gè)重要途徑,多個(gè)研究小組報(bào)告了對(duì)于高膽固醇血癥大鼠、小鼠和倉(cāng)鼠體內(nèi),牛磺酸可提高糞便膽汁酸排泄率[23-26]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠糞便TBA含量顯著高于對(duì)照組,膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化增多,表明在高脂膳食條件下大鼠自身已經(jīng)啟動(dòng)了促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化的機(jī)制,有報(bào)道曾表示大鼠不是建立實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化的良好模型[23];兩個(gè)劑量的牛磺酸組大鼠糞便TBA含量比模型組進(jìn)一步顯著增加,說(shuō)明牛磺酸促進(jìn)了膽固醇向膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化并隨糞便排出。這與以往報(bào)道研究相一致。但牛磺酸未能顯著降低高脂膳食大鼠肝臟TC水平,可能既與大鼠自身啟動(dòng)促進(jìn)膽固醇代謝的機(jī)制有關(guān),也與牛磺酸濃度和攝入時(shí)間周期有關(guān)。提示提高牛磺酸的劑量和加長(zhǎng)攝入時(shí)間可能使血清和肝臟TG/TC水平顯著降低。

高脂飲食會(huì)導(dǎo)致大量經(jīng)消化系統(tǒng)吸收入血的乳糜微粒經(jīng)利用產(chǎn)生的FFA相應(yīng)增加[27],進(jìn)而促進(jìn)糖異生,增加糖原的合成。本研究中高脂模型組大鼠肝臟FFA、糖原較對(duì)照組顯著增多,與模型組相比,兩個(gè)劑量牛磺酸組的肝臟FFA、肝糖原都降低,牛磺酸促進(jìn)了脂肪酸的分解代謝,也減少了因FFA增加而引起的肝糖原合成增加。本文在實(shí)驗(yàn)前8周牛磺酸飲水劑量為0.5%和1%條件下,牛磺酸組大鼠體重與模型組未出現(xiàn)顯著差異。提高牛磺酸劑量到2.5%和5%后,第12周牛磺酸高劑量組大鼠的體重顯著低于模型組且大鼠附睪脂肪墊重和附睪脂肪墊指數(shù)也均顯著低于模型組。以上結(jié)果表明牛磺酸具有促進(jìn)脂代謝、降低體脂肪的作用。其機(jī)制主要是牛磺酸可促進(jìn)脂肪酸的β氧化,刺激能量消耗。秀麗隱桿線蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)顯示,用高脂培養(yǎng)基時(shí),牛磺酸并不影響攝食量,但使線蟲(chóng)的移動(dòng)性增加、脂肪蓄積減少,提示牛磺酸可能通過(guò)刺激能量消耗而減少脂肪沉積[11];還有報(bào)道顯示,在高脂膳食誘導(dǎo)豚鼠脂肪肝的實(shí)驗(yàn)中,牛磺酸使豚鼠體重、血清/肝臟TG含量下降、肝臟脂滴減少、肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的基因表達(dá)顯著上調(diào)[21];谷氨酸鈉誘導(dǎo)大鼠肥胖后,牛磺酸可減少腹膜后脂肪墊量,并使大鼠體溫有所增高,脂肪組織的PPARγ共激活因子1(PGC-1)的表達(dá)增加,這些都表明牛磺酸促進(jìn)了脂肪酸的β氧化,刺激能量消耗[28-29]。

牛磺酸是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸之一,牛磺酸特有的分子結(jié)構(gòu)使它可以通過(guò)抗氧化等作用來(lái)保護(hù)細(xì)胞[30-31]。多個(gè)研究表明牛磺酸可提高血清總抗氧化能力、SOD 和GSH-PX活性[32-34];梁紀(jì)偉等[35]的研究表明牛磺酸可顯著提高糖尿病大鼠紅細(xì)胞SOD、全血GSH-PX,也有研究報(bào)道牛磺酸可以顯著提高幼齡和中齡小鼠等動(dòng)物肝臟中SOD和GSH-PX活性[36]。本文雖各組的SOD未能觀察到顯著變化,但牛磺酸兩個(gè)劑量組血清GSH-PX均顯著高于模型組,肝臟中的還原型GSH和GSH-PX活力也都顯著高于模型組,而GSH-PX和還原型GSH是構(gòu)成機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的一部分,說(shuō)明牛磺酸能夠降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度。研究顯示,氧化型LDL是造成動(dòng)脈粥樣硬化的因素之一,因此牛磺酸的抗氧化作用可能與其影響脂代謝有一定的關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

牛磺酸飲水可很好地降低高脂血癥大鼠的體重和附睪脂肪墊重、降低肝臟FFA水平,促進(jìn)脂質(zhì)代謝而減少肝臟糖元的大量堆積;顯著降低血清TC/LDL-C、升高大鼠糞便TBA水平,起到降低血清膽固醇的作用;還可顯著升高血清GSH-PX、肝臟GSH-PX和還原型GSH水平(p<0.05)。總之,牛磺酸主要通過(guò)促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸并隨糞便排出、加強(qiáng)脂質(zhì)代謝減少肝臟FFA堆積、提高機(jī)體抗氧化能力等途徑發(fā)揮減重降脂功效,但關(guān)于其減重降脂機(jī)制還需深入研究。

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