環介導等溫擴增技術在食品安全檢測領域的應用研究進展

范安妮,佘之蘊,張 娟,周臣清,梁宇斌

(廣東產品質量監督檢驗研究院,廣東順德 528300)

核酸擴增是分子生物學研究領域的一項重要技術,目前已廣泛應用于醫學診斷、食品檢測、動植物檢驗檢疫等行業中。核酸擴增技術分為變溫擴增技術和恒溫擴增技術兩大類。傳統的核酸擴增技術以變溫擴增技術為主,包括常規PCR、梯度PCR、實時熒光定量PCR、巢式PCR、多重PCR等,擴增過程需循環經歷變性、退火、延伸三個基本反應步驟,每個步驟的反應溫度不一,因此擴增過程依賴專業儀器設備進行,同時由于反復調溫,導致反應時間較長。隨著分子生物學研究的不斷深入,Notomi等[1]建立了一種新型的核酸擴增技術:環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。LAMP是利用能識別靶序列上的6個位點的4個特殊設計的引物和一種鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下特異、高效、快速地在體外擴增核酸的新技術。與傳統變溫核酸擴增技術相比,LAMP僅需簡單便宜的恒溫器(水浴、金屬浴、恒溫箱等)即可完成反應,操作簡單,反應的結果通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷,也可通過熒光信號監測來判斷,符合食品快速檢測和現場檢測的需要,在食品檢測領域具有廣闊的應用前景。本文重點介紹LAMP技術在食品微生物檢測、轉基因成分檢測、過敏原成分檢測和動物源性成分檢測領域的應用研究進展,以期為食品快速、高通量檢測技術建立提供參考。

1 環介導等溫擴增技術在食品微生物檢測領域的應用

食源性致病微生物一直是引發食品安全事故的主要因素[2],其產生的疾病嚴重危害公眾健康,因此被列為食品衛生安全檢測的重要指標[3]。開展快速、便捷的食源性致病菌檢驗技術的研究,防止被污染的食品進入市場,對保障消費者健康安全有著極為重要的意義。

1.1 LAMP技術在檢測食品中沙門氏菌方面的應用

沙門氏菌可分離于豬肉、牛肉、雞肉及其加工產品中,是常見的病原菌之一[4-6]。現行國家標準GB 4789.4-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》是采用培養法進行檢測,整個過程需要2～3個工作日,如有可疑菌落,還需要做生化鑒別。王瑾等[7]根據沙門氏菌invA基因序列設計了特異性LAMP引物,建立了沙門氏菌LAMP檢測方法,該方法檢測過程僅需45 min,靈敏度達到6 CFU/管,其靈敏度和準確性與國標法相當,但是檢測時間大大縮短。黃金海等[8]根據沙門氏菌invA基因設計一組環介導等溫擴增引物,檢測7種不同血清型沙門氏菌和4種非沙門氏菌,并與活菌計數法比較,結果表明該方法具有較高的特異性與靈敏性,適用于沙門氏菌污染食品的快速檢測。吳家林等[9]對環介導等溫擴增技術檢測沙門氏菌的反應條件進行優化,包括dNTP濃度,MgCl2濃度,外引物濃度和內引物濃度,優化后該方法對細菌純培養物檢測的靈敏度達到101CFU/mL。有研究表明,環介導等溫擴增技術檢測食品中沙門氏菌的符合率為98%,明顯優于常規PCR技術(90%)[10]。

1.2 LAMP技術在檢測食品中阪崎腸桿菌方面的應用

阪崎腸桿菌為革蘭氏陰性菌,產黃色毒素,可引起新生兒腦膜炎、菌血癥、敗血癥等嚴重疾病。我國國家標準明確規定,適合0～6月齡嬰兒配方食品不得檢出阪崎腸桿菌。胡連霞等[11]以阪崎腸桿菌的16S-23S rRNA區間序列作為靶序列,設計了一套LAMP引物,包括內引物、外引物和環引物。該方法檢測阪崎腸桿菌的靈敏度達到0.101 CFU/mL,人工污染阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為1.1 CFU/g,而PCR方法對照檢測阪崎腸桿菌的檢出限為1.1 CFU/g,人工污染阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為11000 CFU/g,靈敏度明顯低于LAMP。而且LAMP檢測從樣品處理到報告結果,僅需1 h,結果肉眼可判讀,方便快捷。董鑫悅等[12]以阪崎腸桿菌OmpA序列為靶基因設計引物,并對反應條件進行優化,該新建方法檢測阪崎腸桿菌純培養物的靈敏度是PCR方法的10倍,特異性好。

1.3 LAMP技術在檢測食品中蠟樣芽孢桿菌方面的應用

蠟樣芽孢桿菌生存范圍廣,富含蛋白質和碳水化合物的食品,更容易受污染,由于蠟樣芽孢桿菌具有致病性,因此容易引發食物中毒[13-15]。賈雅菁等[16]根據已公布的蠟樣芽胞桿菌hblA基因序列設計內外引物,利用SYBRGreen I作為染料進行實時熒光監測,該方法檢測純菌的靈敏度達到8.2 CFU/mL,反應時間僅需20 min,同時采用21株致病菌(4株蠟樣芽孢桿菌和17株非蠟樣芽孢桿菌)進行特異性實驗,該方法能夠進行準確判讀。

1.4 LAMP技術在檢測食品中單增李斯特菌方面的應用

單增李斯特菌是一種常見的人畜共患的食源性致病菌,可引發腦膜炎、敗血癥等嚴重疾病。其在4 ℃的環境中仍可生長繁殖,因此是冷藏食品中最主要的致病菌[17-18]。張體銀等[19]根據單增李斯特菌hly基因的保守序列設計特異性LAMP引物,LAMP反應在65 ℃下進行,1 h內即可檢出單增李斯特菌,結果表明該方法靈敏度達到100 CFU/mL,對13株致病菌以及50種樣品進行特異性檢測,同時與國標方法進行比較,符合率達到100%,可滿足大批量樣品快速篩選的要求。

綜上所述,與國標檢測方法相比,使用LAMP技術檢測食源性致病菌,檢測時間從3～5 d縮短到1 d即可,為食源性致病菌的快速篩選帶來極大便利,同時也提高了檢測效率。與PCR方法比較,LAMP也顯示出更高的靈敏度。姜侃等[20]建立了一種同時檢測沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的三重LAMP法,分別針對沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、單增李斯特菌hly基因設計三套LAMP引物,優化反應條件,該方法能在90 min內一次性檢出以上3種致病菌,檢測靈敏度是PCR的1000倍。

2 環介導等溫擴增技術在食品轉基因成分檢測領域的應用

據農業生物技術應用國際服務組織(ISAAA)統計,2015年全球種植了近1.8億公頃轉基因農作物,從1996年轉基因作物商業化到2015年,全球轉基因作物累計種植面積達到20億公頃,轉基因作物也擴展到了四大作物(玉米、大豆、棉花和油菜)以外[21]。轉基因農作物即利用基因工程技術,將來源于任何種類的遺傳物質引入到不同種類的植物中[22-23],使其通過遺傳信息的交流以改良農藝性狀、提高品質性狀,例如抗除草劑大豆、抗除草劑玉米、抗蟲大豆、抗蟲玉米、富含高賴氨酸玉米等[24-26]。隨著農業生物技術的發展,為了施行對轉基因作物的有效監管,許多國家和機構都制定了轉基因標識條例,因此建立高效、快速、準確的轉基因產品檢測方法十分關鍵。

目前常用的食品轉基因成分檢測技術分為兩大類,一類是蛋白水平的檢測,通過檢測外源基因的表達產物來判斷。一類是核酸水平的檢測,檢測的靶基因通常是選擇通用元件或者是外源基因。由于核酸比蛋白質穩定,對于經過深加工的轉基因食品,核酸水平的檢測更為廣泛。常規的PCR方法或實時熒光定量PCR方法對設備和人員要求較高,耗時長,無法實現現場快速檢測,而LAMP技術正好彌補了這一缺陷。陳金松等[27]針對轉基因玉米表達載體的花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)設計了一套特異LAMP引物,并對反應體系成分進行優化,結果表明，該方法比常規PCR方法方便快捷、具有更高的靈敏度。閆興華等[28]根據轉基因玉米LY038外源基因cordapA基因設計了4條特異性高的LAMP引物,該檢測體系在63 ℃恒定溫度下反應50 min,即可完成檢測,靈敏度達到0.01%,是常規PCR方法的5倍。周杰等[29]針對DAS-81419-2、DP356043-5、A2704-12、FG72、BPSCV127-9和MON89788等6種常見轉基因大豆的旁側序列,分別設計了LAMP引物,該方法僅需在恒溫條件下反應30 min,即可進行結果判讀,靈敏度達到0.1%。

綜上,LAMP方法檢測食品中的轉基因成分,比PCR方法具有更高的靈敏度,與PCR、實時熒光定量PCR方法相比,反應用時更短,操作更簡單,將來有望成為食品轉基因檢測的主要檢測技術。

3 環介導等溫擴增技術在食品過敏原成分檢測領域的應用

食物過敏是導致皮膚、腸道及呼吸道疾病等多種急性癥狀的重要原因[30],美國每年急診患者中有43%病人的發病由食物過敏引起[31]。目前,治療食物過敏癥最有效最直接的方法就是避免食用含有過敏原的食物,這就要求生產商在食品標簽上正確標示出導致過敏的成分,以免消費者因不知情而誤食引起過敏。各國特別是西方發達國家制定了各種法令或條款對食品過敏原以及食品標簽作出規定[32-34],國際食品法典委員會、美國、歐盟、日本、澳大利亞、新西蘭及其他國家對過敏原標簽都有要求[35-36]。隨著貿易全球化的發展、不同地域間食物的相互流通以及深加工技術的廣泛應用[37-40],過敏人群接觸食物中過敏原的種類日益增多[41-43],因此開發出高靈敏度以及快速的食品過敏原檢測方法勢在必行[44-47]。

現階段國內外常用的檢測食品過敏原成分的方法分為兩大類:免疫學檢測方法和核酸檢測方法。核酸檢測技術具有靈敏、快速、準確的特點,經過深加工后的食品,核酸成分仍然保持一定的穩定性,因此成為主要的檢測技術。本項目組以八大類食物過敏原(花生、堅果、小麥、蝦等)中的典型產品為研究對象,分別篩選出特異性高的過敏原基因片段為檢測對象,設計LAMP引物并優化反應體系,建立一套快速檢測食品過敏原成分的方法。以過敏原小麥成分檢測為例,選取GAG56D基因的特異性高的片段,設計4條LAMP引物和2條環引物,在65 ℃進行恒溫擴增1 h,選用SYBR GreenⅠ作為熒光染料,反應結束后,陰性結果呈現橙色,陽性結果呈現綠色,該方法靈敏度達到0.01%,對50份樣品(小麥原料樣品20份,小麥加工制品23份,未含小麥成分樣品7份)進行檢測,結果與實時熒光定量PCR一致,符合率100%,LAMP檢測時間大大縮短,操作更簡單[48]。

4 環介導等溫擴增技術在食品動物源性成分檢測領域的應用

肉類食品的安全追溯及種屬鑒別已逐漸受到各國政府部門、食品生產企業和消費者的關注。為保證肉類產品質量安全,保障消費者的合法權益,避免市場不公平競爭現象的發生,亟待建立一種能快速準確鑒別、檢測動物源性成分的方法。

當前,國內外對于肉類品種的鑒定方法主要有蛋白質鑒定和核酸鑒定兩大類。蛋白質技術鑒定肉類物種的可靠性和穩定性較差,無法滿足現代肉類摻雜摻假檢測的要求。相比之下,由于DNA的相對穩定性,只要知道動物物種的特異性基因或蛋白的基因序列就能實現檢測。宋濤平等[49]根據雞、鴨、牛、羊物種cytb、cox3、12S rRNA、cytb特異性基因分別設計LAMP引物,在63 ℃恒溫條件下反應45 min后進行結果判讀,該方法對熟肉制品摻雜肉檢測的檢出限達到0.01%。劉少寧等[50]針對狐貍線粒體coxⅠ基因設計一套LAMP引物并對反應條件進行摸索優化,從而建立一種能夠快速檢測出綿羊肉中摻入狐貍源性成分的方法,該方法可檢測出摻假率為1.0%的羊肉制品。譚貴良等[51]針對豬、牛、羊、鴨的線粒體cytb基因分別設計LAMP引物并優化反應參數,建立了食用植物油和地溝油中動物源性成分的LAMP檢測方法,該方法可以快速檢測出混合油脂中的動物源性成分,動物油脂的檢出限為1%,地溝油的檢出限為5%。與常規PCR和實時熒光定量PCR方法相比,LAMP檢測方法不需要依賴昂貴的PCR儀,操作簡單,結果肉眼可判別,方便快捷,可滿足室外檢測及現場執法的要求。

5 基于環介導等溫擴增的芯片技術在食品檢測領域的應用

LAMP技術作為一種等溫核酸擴增技術,以其快速、特異、高效、結果易于判讀的優點,廣泛應用于食品檢測領域。常規的LAMP技術只能檢測1～2個目標序列,隨著生物技術的不斷發展,基因芯片作為分子生物學的一個技術突破,以其高通量、自動化、集成化、微型化的特點,具有強大的發展活力。張國豪等[52]設計了一種基于LAMP原理的微流控芯片,該芯片設有微反應陣列,每張芯片在特定反應池包埋固定一套引物用于一種核酸靶序列的擴增與檢測,可同時對多種核酸靶基因進行高通量并行檢測。目前已有商品化芯片檢測試劑盒應用于食品中多種致病菌的檢測,該試劑盒可定性檢測3種常見食品致病菌,包括:沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和腸出血性大腸埃希氏菌O157。將食品進行增菌后,提取增菌液的核酸作為模板進行擴增,芯片已經包埋了3套引物,一次可檢測3個樣本,每個樣本可同時定性檢測3種致病菌。這為食源性致病菌快篩提供了極大的便利。

6 結論與展望

環介導等溫擴增技術作為一種快速、便捷的核酸檢測手段,與常規PCR、實時熒光定量PCR方法一起成為食品安全檢測的重要工具。我國目前已有基于環介導等溫擴增技術的食品檢測系列標準:包括出口食品中轉基因成分環介導等溫擴增(LAMP)檢測方法和進出口食品中致病菌環介導等溫擴增(LAMP)檢測方法。與傳統的PCR方法相比,LAMP的突出優勢在于:不依賴昂貴的PCR儀,僅需恒溫設備即可;反應時間僅需30～60 min,結果肉眼可判讀;基于LAMP原理的芯片技術,可實現對單一樣品多種靶基因同時檢測,也可實現多樣品的高通量檢測。同樣,該技術也存在一定的問題:LAMP反應需要設計4條引物,為了加快反應速度,通常會再設計2條環引物,引物設計過程比較復雜、費時;當樣品DNA質量不高時,LAMP檢測效果會低于PCR方法[53];食品中存在的多種水溶性DNA聚合酶抑制劑和脂肪等,會影響擴增效果,因此致病菌的快速檢測都需要進行預增菌,從而使檢測時間變長;利用多重LAMP進行多個靶基因的同時檢測時,如何避免引物間的干擾,確保引物的特異性。隨著技術研究的不斷深入,LAMP技術有望得到進一步優化和完善,例如多重LAMP的設計、LAMP與芯片技術的結合,實現快速、特異、靈敏、高通量的目的,這將成為核酸檢測領域的重要工具,可廣泛應用于食品安全檢測、檢驗檢疫、衛生防疫、疾病診斷等領域,前景非常廣闊。

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