黑果腺肋花楸酒對肝損傷小鼠腸道菌群的影響

李棟，侯建革，李艷，2，牟德華*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa），薔薇科、腺肋花楸屬（Aronia melanocarpa Mich Elliott）植物，俗稱不老莓，根據2018年9月國家衛生健康委員會2018年第10號公告，黑果腺肋花楸為新食品原料。黑果腺肋花楸表現出降血脂[1]、降血糖[2]、抗癌[3]、抗炎[4]等多種藥理作用。用其果實釀制的黑果腺肋花楸酒含有較多的單寧、花色苷、黃酮等酚類物質[5]，它們是發揮藥理學作用的重要物質基礎，具有顯著的抗氧化能力。

在人和動物腸道內存在著大量的微生物菌群，生物體腸道健康與這些微生物有著密切的關系[6-8]，它們按照一定比例組合在一起，相互依存、制約、共生，形成相對穩定的腸道微生態[9-12]。宿主腸道為微生物群體提供營養和生存場所[13]，同時這些微生物也對宿主的營養、代謝和免疫功能調節發揮重要作用[14]。在正常腸道微生物菌群中，擬桿菌門及厚壁菌門最多，約占90%[15]，當生物體出現異常時，腸道菌群也隨之發生改變，且隨著生物體的年齡、飲食習慣、生活環境，甚至是心情的改變，都有可能使腸道菌群的改變。相反，腸道菌群也通過其特有的功能屬性，影響宿主的生長和代謝[16]。

D-半乳糖已被廣泛應用于建立實驗性衰老、肝損傷等疾病模型[17]，研究發現，肝臟器官的健康狀態與腸道菌群密切相關，腸道菌群的豐富度受到肝臟的影響，肝臟可以通過膽汁酸和免疫球蛋白A控制和調節腸道菌群[18]。而腸道菌群通過分泌小分子物質調節肝臟的正常功能，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌是腸道的主要益生菌，能夠有效預防感染、維持肝臟正常功能[19]。本實驗旨在研究黑果腺肋花楸酒對D-半乳糖急性肝損小鼠腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑果腺肋花楸酒：秦皇島金樽酒業有限公司。

1.2 實驗動物及分組

昆明小鼠SPF級，四周齡，體重22 g～26 g，雄性，由河北醫科大學提供，許可證號：SCXK（冀）2018-004；實驗動物質量合格證號：2010056。

小鼠適應性飼喂5 d，36只小鼠按平均體重分為3組，分別為：空白對照組（KB），模型對照組（MX）和實驗組（HQ），每組 12 只，分兩籠飼喂，即 KB1、KB2、MX1、MX2、HQ1、HQ2。其中空白對照組（KB）不作處理，正常飼喂；模型對照組（MX）按500 mg/（kg·d）的劑量注射D-半乳糖，直到實驗結束；實驗組（HQ），第一周同模型對照組，注射相同劑量D-半乳糖。后3周按照2 mL/（kg·d）的劑量灌胃黑果腺肋花楸酒。飼喂5周后，刺激小鼠排便，無菌eppendorf管收集糞便，-80℃冰箱暫存。

1.3 儀器與設備

AR1140電子分析天平：美國奧豪斯儀器有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；D-1-70型自動控制壓力蒸汽滅菌鍋：北京發恩科貿有限公司；7HZ-82A水浴恒溫振蕩器：常州榮華儀器制造有限公司；902型-80℃冰箱：美國賽默飛世爾科技公司；NOVASEQ高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.4 高通量測序檢測小鼠腸道菌群多樣性

每組隨機選取6只小鼠糞便樣品，48 h內保持低溫送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行高通量測序。上游引物F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，下游引物R：TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT，測序區域：16S rRNA的V3-V4區。

1.5 數據處理

對測序結果雙端合并后，用DADA2[20]方法進行去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體等。生成擴增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASV）特征序列和ASV表格，并去除序列總數僅為1的ASV。基于Greengene-13數據庫進行物種注釋。通過Alpha多樣性，非量度多維尺度，基于屬水平物種方法對腸道菌群進行多樣性及物種分類的差異性分析。剔除組間差異性較大的小鼠腸道菌群數據最終分析KB1_4、KB2_2、KB2_4、KB2_6、MX1_6、MX2_2、MX2_3、MX2_6、HQ1_1、HQ1_2、HQ1_5、HQ2_4。同時提交 NCBI數據庫進行登錄樣品信息，獲得登錄號為：PRJNA692530。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果

經過雙端合并后，得到55 392條特征序列，經抽平后得到54 017條代表性序列，其序列長度最小值為319 bp，最大432 bp，平均422 bp，基本與16S rRNA V3-V4區的長度相符合。

2.2 Alpha多樣性結果

2.2.1 Alpha多樣性指數

Alpha多樣性指數見圖1。

圖1 Alpha多樣性指數Fig.1 Alpha diversity index

由圖1可知，KB組與MX組在Chao1[21]多樣性指數、Faith′s PD[22]指數、Good′s coverage[23]多樣性指數、Pielou′sevenness[24]指數有明顯差異，MX 組 Faith′sPD指數、Good′s coverage 多樣性指數、Pielou′s evenness指數明顯高于KB組，說明MX組中小鼠注射D-半乳糖后，導致腸道菌群多樣性改變，造模成功。Faith′s PD指數相差較大，說明群落中物種的親緣關系很遠，通過Faith′s PD指數可看出MX組菌群與KB組菌群的親緣關系相差較大。HQ組在各個指數上都接近于KB組，說明在一定程度上，黑果腺肋花楸酒對肝損傷后小鼠的腸道菌群有改善與修復作用。

2.2.2 稀釋曲線

稀疏曲線是生態學領域的一種常用方法，通過從每個樣本中隨機抽取一定數量的序列（即在不超過現有樣本測序量的某個深度下進行重抽樣），可以預測樣本在一系列給定的測序深度下，所可能包含的物種總數及其中每個物種的相對豐度[25-26]。稀釋曲線的平緩程度反映了測序深度對于觀測樣本多樣性影響的大小，曲線越平緩，表明測序結果已足夠反映當前樣本所包含的多樣性，繼續增加測序深度已無法檢測到大量的尚未發現的新ASV；反之，則表明Alpha多樣性尚未接近飽和。小鼠便樣稀釋曲線見圖2。

圖2 各組樣本平均Shannon指數曲線Fig.2 The average Shannon index curve of each group of samples

由圖2可知，在序列數達到50 000后，曲線已接近平緩，說明測序量已接近飽和，反映了樣品中微生物的物種信息。同時還可看出，當曲線達到平緩時，MX組與KB組在物種多樣性上有明顯的差距，說明肝損傷的小鼠腸道菌群多樣性相對減少，而HQ組與KB組接近，說明黑果腺肋花楸酒對肝損傷的小鼠腸道菌群多樣性有效改善。

2.2.3 豐度等級曲線

豐度等級曲線可以直觀地反映群落中高豐度和稀有ASV的數量。

每條折線代表一個樣本，折線在橫軸上的長度反映了該樣本具有該豐度ASV的數目。折線的平緩程度，反映了群落組成的均勻度，折線越平緩，則群落中各ASV間的豐度差異越小，群落組成的均勻度越高，折線越陡峭，則均勻度越低。小鼠便樣的豐度曲線見圖3。

圖3 豐度等級曲線Fig.3 Rank-abundance curve

由圖3可知，MX組與KB組的ASV有很大差異，HQ組與MX組差別也很大，與KB組相似，說明黑果腺肋花楸酒對于肝損傷小鼠腸道菌群的豐度有明顯改變，使其更接近于正常組小鼠樣品的豐度，證明黑果腺肋花楸酒對肝損傷小鼠腸道菌群有明顯的修復作用。

2.3 非量度多維尺度分析

非量度多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）是通過對樣本距離矩陣作降維分解，簡化數據結構，從而在特定距離尺度下描述樣本的分布特征。NMDS分析不依賴于特征根和特征向量的計算，而是通過對樣本距離進行等級排序，使樣本在低維空間中的排序盡可能符合彼此之間的相似距離的遠近關系（而非確切的距離數值）。因此，NMDS分析不受樣本距離的數值影響，僅考慮彼此之間的大小關系，對于結構復雜的數據，排序結果可能更穩定。NMDS結果的應力值越小越好，一般認為當該值小于0.2時，NMDS分析的結果較可靠，圖中每個點代表一個樣本，不同標識的點指示不同的樣本或組。由于NMDS采用等級排序，因此可近似認為兩點之間的距離越近，表明兩個樣本中微生物群落的差異越小。非量度多維尺度分析圖見圖4。

圖4 非量度多維尺度分析圖Fig.4 Non-metric multidimensional scale analysis graph

由圖4可以看出，HQ組樣本與KB組樣本在圖中位置直線距離比MX組與KB組的直線距離更近，說明MX組與KB組腸道微生物群落的差距較大，而HQ組與KB組的差距相對較小。說明黑果腺肋花楸酒使得肝損傷小鼠腸道菌群群落更加接近正常小鼠。

2.4 基于屬水平的菌群分析

基于屬水平3組小鼠腸道菌群物種組成分析見圖5。基于屬水平3組小鼠腸道菌群進化樹圖見圖6。

圖5 基于屬水平3組小鼠腸道菌群物種組成分析Fig.5 Analysis of species composition of intestinal flora in 3 groups of mice based on genus level

圖6 基于屬水平3組小鼠腸道菌群進化樹圖Fig.6 Evolutionary tree diagram of 3 groups of mouse intestinal flora based on genus level

由圖5可看出3組樣品主勢菌群的數量及比例，圖6說明主勢菌群的親緣關系。MX組與KB組小鼠的腸道菌群中主勢菌群的差異性明顯。KB組小鼠便樣的主勢菌群占腸道菌群總量的35.2%，MX組僅為24.33%，而HQ組是36.36%。MX組在屬水平腸道菌群排名前十的主勢菌群比KB組減少很多，而HQ組比KB組還略高。擬桿菌屬（Bacteroides）在3組樣品中均占有主導優勢，它是G-、無芽胞、專性厭氧的小桿菌，為正常寄居于人和動物的腸道、口腔、上呼吸道和生殖道的菌，可以分解蛋白胨或葡萄糖，產生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等。MX組小鼠的腸道菌中擬桿菌屬比KB組減少3.61%，而HQ組相比KB組增長10.5%。訾雨歌等[27]通過構建D-半乳糖誘導小鼠衰老模型，也發現模型對照組中擬桿菌屬數量下降。乳桿菌屬（Lactobacillus）是一種優質的益生菌，已有大量文獻資料表明其具有促進腸上皮細胞增殖、參與調解結腸黏液層、重塑黏蛋白糖基化等功能[28]。李海燕等[29]通過構建急性肝衰竭小鼠模型，發現乳酸桿菌數量下降。阿克曼氏菌屬（Akkermansia）是最近新發現的益生菌，具有改善糖尿病大鼠肝功能、減少糖毒性和脂毒性、緩解氧化應激反應、抑制炎癥和恢復正常的腸道菌群等功能。阿克曼氏菌和瘤胃球菌科在長壽老人糞菌中相對豐度均較高，可能成為長壽信號之一[30-31]。以上從某種程度說明，肝損傷小鼠（MX組）的腸道菌群在屬水平上與正常小鼠（KB組）差異顯著，而黑果腺肋花楸酒對已經肝損傷小鼠的腸道菌群具有一定的修復作用，這種作用的體現是因為本實驗所用黑果腺肋花楸酒中含有多酚和黃酮類物質，其含量分別為1.46 g/L和12.62 g/L，與Witkowska等[32]研究結果相似，但約12%vol的乙醇含量對肝也有損害作用，實驗證明兩權之間正作用大于副作用。

3 結論

MX組、HQ組與KB組比較發現，黑果腺肋花楸酒在一定程度上可以改善肝損傷小鼠腸道菌群，使得肝損傷后的小鼠腸道菌群豐富度基本與正常組相似。模型對照組小鼠肝損傷增加了腸道菌群的豐富度，但通過Faith′s PD指數可看出，增加的菌群種類與正常的種類在親緣關系上有很大差異，說明，這些新增菌群可能與肝損傷有關。在非量度多維尺度分析也可以看出，HQ組比MX組跟KB組更相似。屬水平看出，MX組相對KB組的主勢菌群大幅度減少，而HQ組的主勢菌群數量相對有所修復。本研究為黑果腺肋花楸酒的釀造、飲用及市場開發提供理論依據。