豬弓形蟲感染的血清肽譜診斷法建立及初步應用

郝福星， 左偉勇， 劉 莉，2

(1.江蘇農牧科技職業學院/江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇泰州 225300； 2.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009)

弓形蟲病是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種人獸共患寄生蟲病，宿主種類十分廣泛[1]。貓科動物是弓形蟲的終末宿主[2]，在貓體內弓形蟲進行有性生殖產生卵囊，卵囊隨貓的糞便排出體外，并發育成具有感染性的孢子化卵囊，后者能夠感染人和大多數的溫血動物。人因與動物接觸、誤食了受弓形蟲卵囊污染的水源、土壤或食物(肉、蛋)，會引起弓形蟲感染[3]。據文獻報道，人和動物感染呈世界范圍內分布，人群的平均感染率25%～50%，多呈隱性感染，推算全世界約1/4的人感染弓形蟲[4]；感染弓形蟲的動物種類很多，如家畜、家禽、鼠以及魚類，可引起豬、牛、羊、犬、雞等畜禽發病，可引起大批發病，死亡率高，給畜牧業生產造成嚴重經濟損失[5-7]。而豬作為人類最主要的肉產品來源之一，檢測其弓形蟲感染狀況，在公共衛生與食品安全方面意義重大[7]。因此，開展豬弓形蟲病的研究工作，對畜牧業發展和人類健康具有重要的經濟價值和社會意義。

弓形蟲感染的診斷主要包括病原學檢測、免疫學診斷及分子生物學診斷技術[8]。病原學檢測方法有直接涂片與組織切片染色法，該法可對弓形蟲急性感染進行確診，但存在費時費力的缺點，對弓形蟲隱性感染的檢測效能不強；動物接種試驗和細胞培養法能夠直接確認病原體存在，但敏感性低、耗時、易漏診且難以應用于實際操作。以間接血凝試驗(IHA)與酶聯免疫吸附試驗(ELISA)為主的免疫學診斷方法[9]具有特異性強、敏感性高、操作簡便等優點，是弓形蟲病流行病學調查和診斷最常用的方法，但有報道顯示，臨床診斷中也存在假陽性，需要與其他診斷方法綜合判定[10]。以PCR為主的分子生物學診斷技術[11]具有靈敏度高的特點，但是因檢測樣本(如外周血)復雜與PCR技術本身等原因也存在假陽性高、準確性較差等缺點。因此，迫切需要建立一種準確性好、快速靈敏的檢測方法。

筆者利用MALDI-TOF質譜結合ClinProTool分析在小鼠動物模型上已能成功對弓形蟲感染進行判定[12]。有文獻顯示，該方法在包括血吸蟲感染、腫瘤、神經系統疾病診斷中也有較廣泛的應用[13]，具有高通量、靈敏度高、可重復性好及樣本需求量少等優勢，本研究擬建立一種快速準確診斷豬弓形蟲感染的方法，對江蘇泰州部分地區豬場的弓形蟲感染情況做一調查，為當地豬的養殖與防病提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 受試動物與試劑

江蘇省泰州市轄區(海陵、高港、姜堰)小型豬場(<100頭豬)育肥豬，共采集3個豬場，每個豬場采集50頭。

弓形蟲間接血凝試驗凍干抗原(IHA抗原，批號：20151011)；標準陽性血清、標準陰性血清、稀釋液(批號：20151011)，均購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。MB-WCX磁珠純化試劑盒(美國Bruker Daltonic公司)，丙酮、甲醇、異丙醇、乙腈、三氟乙酸、甲酸等均為色譜純級?；|：HCCA(α-氰-4-羥肉桂酸)，300 mg/L，溶于乙醇 ∶丙酮=2 ∶1，新鮮配制。

1.2 血清采集與分離

每頭豬行耳靜脈采血2～2.5 mL，將采集的新鮮血液，加入1.5 mL無菌EP管中，即刻置于4 ℃冰箱保存，待30 min后以12 000 r/min、4 ℃離心10 min，分離血清冷凍于-80 ℃冰箱待測。

1.3 弓形蟲IHA診斷方法

按照試劑說明書進行操作，即于96孔有機玻璃板加入75 μL稀釋液，每個待檢血清樣品加稀釋液4孔，取25 μL血清加入第一孔，混勻后吸取25 μL加入第二孔，以此類推，進行倍比稀釋。待檢血清加完后，每孔加入25 μL診斷液，將反應板放至微量振蕩器上振蕩1～2 min，靜置于22～37 ℃恒溫箱中作用2～3 h后觀察結果。每批次均需設陽性對照與陰性對照。

1.4 血清肽質譜檢測法

根據磁珠純化血清多肽試劑盒標準操作規程，將10 μL樣本結合液與10 μL磁珠試劑混合，與血清樣本10 μL混勻并室溫靜置5 min；將磁珠進行富集并棄上清，清洗磁珠后加洗脫液(ES)5 μL與磁珠混勻，室溫靜置5 min后置磁珠富集器并棄上清，最后加5 μL穩定液(SS)至離心管并混勻，取 1 μL 與基質10 μL完全混合，制成混懸液，取1 μL混懸液點靶，室溫干燥后上機檢測，設置MALDI-TOF-MS儀器參數，選擇LP-Clinprot.pa方法，靶MTP_polished steel 384，激光能量在40%左右，檢測分子量范圍為m/z800～12 000；應用flexanalysis與Clin ProTools軟件對采集圖譜進行分析，應用MASCOT數據庫對差異多肽峰進行初步搜庫鑒定。

2 結果與分析

2.1 血清間接血凝試驗結果

根據IHA陽性結果標準，在陽性對照血清效價不低于 1 ∶1 024，陰性對照孔血清除第1孔允許有前滯現象“+”外，其余各孔及對照孔均為“?”的前提下，對被檢血清進行判定，被檢血清抗體效價達到或超過1 ∶64為陽性。結果顯示，本研究采集的泰州市轄區(海陵、高港、姜堰)3個小型豬場的150頭份血清樣本中陽性血清為25份，陽性率為16.67%(表1)。

表1 泰州部分地區豬弓形蟲感染情況調查(IHA法)

2.2 血清多肽指紋圖譜分析

將25份IHA陽性血清與125份陰性血清分別歸為感染組與對照組，利用磁珠純化血清多肽，并與基質混勻后點靶進行質譜檢測。結果顯示，與陰性對照組相比，IHA陽性組豬血清中在m/z1 608.59、1 971.84、5 004.01、4 617.49、7 808.23的5個多肽峰的表達顯著上調，而m/z1 233.01、8 007.66、2 356.37、3 735.65的4個峰呈顯著下調(表2)。

表2 豬弓形蟲感染組與對照組血清差異表達多肽(ClinProTool法)

注：“*”表達上調，“**”表達下調。

2.3 弓形蟲檢測方法的建立與驗證

將血清多肽指紋圖譜導入Clin ProTools軟件，并將IHA陽性血清與陰性血清進行分組，尋找并依據組間譜圖差異，建立豬的弓形蟲感染診斷方法，為驗證診斷方法的敏感性與特異性，將陽性與陰性血清指紋圖譜導入，質譜可自動化判定，結果顯示，25份IHA陽性血清可以成功被質譜診斷模型判定為弓形蟲感染，敏感性達100%，而125份陰性血清中有119份可被判定為未感染，準確性達95.2%(119/125)，另6份不能判定。

3 結論與討論

豬弓形蟲病呈世界范圍流行，我國分布十分廣泛，食入貓糞便中的卵囊、通過損傷的黏膜與皮膚、母豬孕期經胎盤感染仔豬，均為本病的感染途徑[14]。規模化、現代化的養殖方式雖可以避免傳統粗放養殖中的寄生蟲感染情況，如疥螨和蛔蟲等感染率得以大大降低，但畜牧場外部環境、豬群內部引進和繁殖等一系列環節的存在，使得弓形蟲仍然有較高的感染機會，甚至呈暴發流行[15]，而弓形蟲作為人獸共患寄生蟲病，禽、犬、貓等多種動物均可攜帶[16]，對公共衛生威脅更大，有必要對該病進行重點防控。有報道顯示，部分豬場發病率可高達60%以上[17]，病死率可高達64%。隨著養殖水平提高，該病在我國多呈隱性感染，一旦疏于防范，有可能造成弓形蟲病的流行和暴發，因此，對規模化養殖豬場尤其要加強該病的監測。相比傳統的檢測方法，血清多肽指紋圖譜檢測法具有高通量、檢測效率高的優勢，且在實驗小鼠[18]、家兔[19]等動物已成功建立了寄生蟲病的診斷方法，在豬的弓形蟲感染診斷中，還較少見報道。

MALDI-TOF質譜結合Clin ProTools軟件分析，可以將弓形蟲感染與未感染豬血清中的多肽進行區別，并以血清差異表達多肽建立診斷方法，對該方法的驗證結果顯示，與傳統的IHA方法一致，可以用于豬感染弓形蟲的診斷與早期篩查。本研究采用的質譜檢測法，可以在30～60 min內實現384個樣本的檢測，具有高通量、快速、自動化程度高等特點，且血清樣本需求量為傳統IHA實驗的1/20，很大程度上減少受試豬的失血量。對血清差異表達多肽的檢測與MASCOT搜庫分析顯示，與筆者之前的研究比較，m/z1 971.84、5 004.01 同樣出現在弓形蟲感染的小鼠與本研究選取的IHA陽性豬血清中，經二級質譜鑒定，該2種多肽分子可能為弓形蟲表面膜蛋白的片段，有望成為弓形蟲感染動物的指征性分子。ClinProTools分析顯示，利用豬血清中9個差異性多肽峰建立診斷方法，其敏感性與準確性較高，該方法以多個差異多肽作為判斷指標，其準確性要優于單一指標，且血清多肽檢測方法是建立在群體基礎上，更好地規避了個體差異，在同組血清樣本中能夠最大限度地體現共性，可重復性強。因此，該方法有望成為判定豬弓形蟲感染狀況的輔助篩查手段。

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