miR-93在多囊卵巢綜合征患者血清中的表達及臨床意義

李 英 ，張學軍

（1.天津醫科大學免疫學系，天津300070；2.天津市中心婦產科醫院檢驗科，天津300100）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）在育齡期女性中是一種發病率較高的生殖內分泌疾病，在女性無排卵不孕癥病因中約占75%，全球約5%～10%的育齡婦女受其影響[1]。其主要特點是卵巢多囊、雄激素過多癥、胰島素抵抗和持續無排卵[2-3]，主要臨床表現為月經周期不規律、不孕、多毛和/或痤瘡。微小 RNA（microRNA，miRNA）是屬于表觀遺傳學研究領域的一類非編碼單鏈RNA分子，由內源基因編碼，長度約為20～24個核苷酸，參與轉錄后基因表達調控，在細胞增殖、分化、凋亡，和某些特定器官的發育以及人類多種疾病的發生發展過程中發揮著非常重要的作用[4-5]。近年來，越來越多的研究結果顯示，PCOS患者的血清以及卵泡液中有miRNA存在[6-8]，并且其表達水平與健康人相比具有顯著差異，由此推測miRNA或可作為一種生物標志物，對深入研究PCOS的發病機理和臨床診治都具有非常積極的意義。本研究旨在探討miR-93在PCOS患者血清中的表達及臨床意義，為PCOS的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年12月-2015年12月在天津市中心婦產科醫院就診的符合鹿特丹標準[9]的PCOS患者25例為試驗組，年齡23～42歲，平均（30.40±1.32）歲；選擇同期孕前體檢的卵巢功能正常者25例為對照組，年齡21～41歲，平均（28.52±0.99）歲，并記錄所有受試者的身高和體質量。兩組年齡無顯著性差異（t=1.144，P=0.258）。本研究通過醫院倫理委員會的認證并取得所有受試者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 晨起空腹抽肘靜脈血3 mL，在37℃水浴箱中放置30 min或在室溫條件下放置1 h，然后 4 000 r/min，4℃條件下離心 5 min，將分離出的血清置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測血清miR-93表達 采用天根生化科技北京有限公司的miRcute miRNA isolation kit，嚴格按照操作說明書提取血清中的總RNA，利用分光光度計檢測其濃度及純度后依照逆轉錄過程說明將RNA逆轉錄為cDNA，以U6為內參，在ABI StepOneTM實時熒光定量PCR儀上進行擴增。miR-93引物序列：正義鏈5′-GAGCTCTAGATGGGGGCCAGGC-3′,反義鏈 5′-ACGCGTCCTAAATG TGAATAAGT-3′。U6 引物序列：正義鏈 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應體系 25μL：TransStart Top Green qPCR Super Mix（2×）12.5 μL，cDNA 模板 2 μL，引物各 1 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，DEPC 水 8 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95℃變性15 s，55℃退火 30 s，70℃延伸30 s，共40個循環。逆轉錄和熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，引物由TaKaRa生物工程有限公司合成。采用2-△△CT法分析miR-93相對表達量，每個樣本PCR反應均設置3個復孔并獨立重復實驗2次。

1.2.3 FBG、TT和HOMA-IR的檢測 利用貝克曼庫爾特Synchron LX 20生化分析儀測定FBG，并利用化學發光法檢測TT和胰島素水平（INS），具體操作步驟嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行。HOMAIR=FBG×INS/22.5。BMI=體質量（kg）/身高（m2）。

1.3 統計學方法 使用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行統計學處理。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗；相關性分析采用雙變量Spearman秩相關檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線用于評價血清miR-93在PCOS中的診斷價值。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCOS 患者與對照組血清 miR-93、BMI、FBG、TT和HOMA-IR的比較 PCOS患者血清miR-93表達水平為2.70（2.10，3.15），顯著高于對照組1.01（0.55，1.40），差異有統計學意義（P＜0.01）；PCOS患者BMI、FBG、TT和HOMA-IR均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清miR-93、BMI、FBG、TT和HOMA-IR的比較Tab 1 Comparison of serum miR-93,BMI,FBG,TT and HOMA-IR between two groups

2.2 兩組患者血清中miR-93的表達水平與TT、HOMA-IR的相關性分析 在正常對照組，miR-93的表達水平與TT、HOMA-IR的相關性分析結果顯示，r分別為0.03和0.39，P分別為0.95和0.13。在PCOS組，miR-93的表達水平與TT、HOMA-IR的相關性分析結果顯示，r分別為0.33和0.28；P分別為0.09和0.47。由此可見，兩組患者血清miR-93的表達水平與血清總睪酮、胰島素抵抗指數不具有相關性。

2.3 血清miR-93用于診斷PCOS的ROC曲線分析 ROC曲線分析結果顯示血清miR-93對PCOS可能具有潛在的診斷價值，曲線下面積（AUC）為0.73，敏感度為70%，特異度為78%，正確診斷指數為 55%，95%置信區間（CI）為[0.59-0.87]。見圖 1。

圖1 血清miR-93診斷PCOS的ROC曲線Fig 1 ROC curve of serum miR-93 for diagnosis of PCOS

3 討論

PCOS可導致女性不孕，還會誘發2型糖尿病、肥胖以及心腦血管疾病等多種代謝性疾病。本研究首先分析了PCOS患者與對照組的一些基本情況，結果表明PCOS患者的BMI、FBG、TT和HOMA-IR均明顯高于卵巢功能正常者，差異具有統計學意義。PCOS患者表現為肥胖、高雄激素血癥和胰島素抵抗。已有研究報道，針對肥胖、胰島素抵抗和高雄激素血癥的治療措施，對于改善大多數PCOS患者的臨床癥狀和體征亦均有效[10]。

miRNA具有組織特異性，主要通過與靶基因mRNA3′端非編碼區域 （3′-untranslated region,3′UTR）互補配對，對靶基因mRNA進行切割或翻譯抑制[11]。研究表明，miRNA具有抗核酸酶活性和容易獲取等優勢[12]，且在血清中豐富、穩定表達，因此血清miRNA可能被用作某些疾病潛在的、簡便無創的診斷指標。Sorensen等[13]研究結果表明，與正常人相比，miRNA在PCOS患者卵泡液中的表達水平有顯著差異，由此推測異常的miRNA表達可能與PCOS的發病機制有關。Song等[14]研究結果顯示，與健康對照者相比，miR-592在PCOS患者血清中的表達水平顯著下調；過表達miR-592可通過負調控LHCGR的表達發揮抑制人卵巢顆粒細胞的活力并阻滯細胞從G1期轉化為S期的作用。

本研究顯示，PCOS患者血清中miR-93的表達量明顯高于正常對照組，與miR-93在PCOS患者脂肪組織中的表達趨勢相似[15]，提示其與PCOS的發病可能有一定的關聯。值得注意的是，本研究利用兩變量相關性分析方法對miR-93的表達水平與血清總睪酮水平、胰島素抵抗指數之間的相關性進行了分析，實驗結果顯示，兩組患者血清中miR-93的表達水平與睪酮、胰島素抵抗指數均無明顯相關。由此可見，PCOS患者血清miR-93表達水平的增高是不依賴于患者胰島素水平、胰島素抵抗、高雄激素血癥等因素的。

在診斷醫學研究中，ROC曲線不僅可顯示出診斷方法的敏感度及特異度之間的相互關系，并且可用于評價疾病診斷方法的準確性。本研究利用ROC曲線分析顯示miR-93診斷PCOS的靈敏度和特異度分別為70%和78%，具有一定的診斷價值。Sathyapalan等[16]研究發現，miR-93和 miR-223在PCOS患者血清中表達水平顯著高于卵巢功能正常對照者，且miR-93診斷PCOS的敏感性和特異性均高于miR-223，即miR-93的診斷價值優于miR-223；使用多元邏輯回歸分析發現，聯合miR-93和miR-223診斷PCOS的敏感性和特異性無明顯增高。也有學者報道雖然作為一個單一的診斷指標，其靈敏度和特異性都稍低，然而miR-93可能是一個用于支持PCOS陽性診斷而不是作為一種排除PCOS診斷的生物標志物，這對于診斷困難的青春期或在圍絕經期的更年期女性是有幫助的[17]。

綜上所述，miR-93可能作為一種生物標志物，為PCOS的診治提供新靶點。然而，miR-93在PCOS中所發揮的具體作用以及作用機制仍不清楚，有待進一步深入研究。

[1]Ehrmann D.Polycystic ovary syndrome[J].N Engl J Med,2005,352(12)：1223

[2]Dasgupta S,Reddy B M.The role of epistasis in the etiology of polycystic ovary syndrome among Indian women：SNP-SNP and SNP-Environment interactions[J].Ann Hum Genet,2013,77(4)：288

[3]Fux O C,Fiol de cuneo M,Szafryk de mereshian P.Polycystic ovary syndrome：physiopathology review[J].Rev Fac Cien Med Univ Nac Cordoba,2013,70(1)：27

[4]Imbar T,Eisenberg I.Regulatory role of microRNAs in ovarian function[J].Fertil Steril,2014,101(6)：1524

[5]Xu Q,Zhang Y,Chen Y,et al.Identification and differential expression of microRNAs in ovaries of laying and broody geese(anser cygnoides)by solexa sequencing[J].PLoS One,2014,9(2)：e87920

[6]Hanson E K,Lubenow H,Ballantyne J.Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs[J].Anal Biochem,2009,387(2)：303

[7]Mitchell P S,Parkin R K,Kroh E M,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(30)：10513

[8]Kang L,Cui X,Zhang Y,et al.Identification of miRNAs associated with sexual maturity in chicken ovary by Illumina small RNA deep sequencing[J].BMC Genomics,2013,14（1）：352

[9]Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and longterm health risks related to polycystic ovary syndrome[J].Fertil Steril,2004,81(1)：19

[10]Ibá?ez L,Del Río L,Díaz M,et al.Normalizing ovulation rate by preferential reduction of hepato-visceral fat in adolescent girls with polycystic ovary syndrome[J].J Adolesc Health,2017,61(4)：446

[11]Johnson E L,Robinson D G,Coller H A.Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patternsinafibroblastmodelof quiescence[J].BMC Genomics,2017,18(1)：123

[12]Murphy M S,Casselman R C,Tayade C,et al.Differential expression of plasma microRNA in preeclamptic patients at delivery and 1 year postpartum[J].Am J Obstet Gynecol,2015,213(3)：367.e1

[13]Sorensen A E,Wissing M L,Salo S A,et al.MicroRNAs related to polycystic ovary syndrome(PCOS)[J].Genes(Basel),2014,5(3)：684

[14]song J,Luo S,Li S W.MiRNA-592 is downregulated and may target LHCGR in polycystic ovary syndrome patients[J].Reprod Biol,2015,15(4)：229

[15]Zhou T,Meng X,Che H,et al.Regulation of insulin resistance by multiple miRNAs via targeting the GLUT4 signalling pathway[J].Cell Physiol Biochem,2016,38(5)：2063

[16]Sathyapalan T,David R,Gooderham N J,et al.Increased expression of circulating miRNA-93 in women with polycystic ovary syndrome may represent a novel,non-invasive biomarker for diagnosis[J].Sci Rep,2015,5：16890

[17]Fields E L,Trent M E.Treatment considerations for the cardiometabolicsignsofpolycysticovarysyndrome：Areviewoftheliteraturesincethe 2013 endocrine society clinical practice guidelines[J].JAMAPediatr,2016,170(5)：502