雞源大腸桿菌中耐藥基因blaCTX-M的水平轉移研究

張冬冬，王紅寧

（四川大學生命科學學院，四川省動物疫病預防與食品安全四川省重點實驗室，“985工程”西南資源環境與災害防治科技創新平臺，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064）

禽致病性大腸桿菌是規模化雞場中最常見的病原菌之一，大多數易引起感染性疾病如大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫（Hjarre氏病）、腹膜炎、氣囊病（慢性呼吸道病，CRD）、腫頭綜合癥、輸卵管炎、滑膜炎、卵黃囊感染等，最終導致家禽死亡[1]。規模化雞場中，β-內酰胺類抗生素是治療腸桿菌引起的感染性疾病的主要藥物，由于長期的不規范用藥，造成了大量耐藥菌的形成。其中，超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是近年來最常見的可以為大腸桿菌提供多種β內酰胺類抗生素耐藥性的一類水解酶，分為CTX-M、SHV和TEM等多種變異型。近年來，產CTXM型ESBLs的細菌不僅在畜禽中大量分離出來，在人醫臨床上造成的耐藥性問題也十分突出[2]。blaCTX-M基因通常由質粒攜帶，因此blaCTX-M基因很容易隨著耐藥質粒的移動在種內甚至是不同種屬細菌間廣泛散播，即耐藥性的水平傳播。

本研究對29株從四川省規模化雞場中分離到的產CTX-M型ESBLs的大腸桿菌進行了接合試驗，并對接合子進行耐藥表型和基因型檢測，探究產ESBLs雞源大腸桿菌中耐藥基因blaCTX-M的水平轉移情況，為臨床預防ESBLs的傳播提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 29株產ESBLs雞源大腸桿菌，從四川省內5個規模化雞場中分離篩選得出；耐利福平的受體菌是大腸桿菌C600，為復旦大學華山醫學院王明貴教授惠贈，對其他藥物敏感。

1.2 主要試劑 OXOID藥敏紙片，LB液體培養基，MH 瓊脂，2×Taq Plus PCR MasterMix，GoldView 染料，瓊脂糖，DNA Marker 2000 plus，孔徑 0.22μm 濾膜，利福平，頭孢噻肟干粉。

1.3 產ESBLs雞源大腸桿菌中blaCTX-M基因的檢測 采用煮沸法提取大腸桿菌DNA為模板，按參考文獻[3]中blaCTX-M基因檢測引物序列（blaCTX-M-1group：F-GGTTAAAAAATCACTGCGTC，R-TTGGTGACGAT TTTAGCCGC；blaCTX-M-9group：F-ATGGTGACAAAGA GAGTGCA，R-CCCTTCGGCGATGATTCTC；blaCTX-M-2group：F-ATGATGACTCAGAGCATTCG，R-TGGGTT ACGATTTTCGCCGC）合成引物，PCR反應體系為25μL：2×Taq Plus PCR MasterMix12.5μL，模板 2μL，去離子水 8.5μL，引物 F、R（10μM）各 1μL。PCR擴增反應條件為：95℃、4min；95℃、30s，55～56℃、30 s，72℃、1min，32次循環；72℃延伸 10min；12℃保存。取5μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性PCR產物送成都擎科公司測序。測序結果利用NCBI的Blast搜索軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對分析，以確定blaCTX-M的基因亞型。

1.4 接合試驗 首先，將29株供體菌接種在含利福平（400μg/mL）的TSA平板上，檢測供體菌的利福平抗性。若供體菌有利福平抗性，則不能進行接合轉移試驗。參考濾膜接合法[4]進行質粒接合轉移試驗：將篩選出的供體菌和受體菌分別在含頭孢噻肟（4μg/mL）和利福平（400μg/mL）的TSA平板上劃線，37℃恒溫培養過夜；次日挑取供體菌及受體菌的單菌落接種于LB液體培養基中，37℃培養4.5h后，分別用生理鹽水稀釋1000倍，取50μL受體菌與50μL供體菌于1.5mL離心管中混合；取混合物置于TSA平板內的0.22μm濾膜中央，37℃孵育15h；將濾膜移至5mL無菌離心管中，加入2mL生理鹽水，使用振蕩器清洗膜上的細菌；取100μL菌懸液涂雙抗（頭孢噻肟4μg/mL和疊氮鈉400μg/mL）TSA平板，同時稀釋1000倍涂無抗TSA平板，37℃培養過夜，次日計算菌株接合效率。接合效率=（接合子數目×103）/（0.5×無抗平板菌落數目×106）。

挑取雙抗平板上的接合子單菌落，接種于含雙抗的LB液體培養基中（含頭孢噻肟2μg/mL和疊氮鈉200μg/mL），37℃ 180r/min培養過夜，用于后續試驗。

1.5 供體菌和接合子的耐藥表型及blaCTX-M基因型比較 根據CLSI 2013年的標準，采用K-B紙片擴散法對供體菌和接合子進行10種抗菌藥的耐藥表型檢測，分別為：頭孢噻肟（CTX）、阿莫西林-棒酸（AMC）、頭孢他啶（CAZ）、阿米卡星（AK）、慶大霉素（CN）、多粘菌素 B（PB）、復方新諾明（SXT）、環丙沙星（CIP）、多西環素（DO）、氟苯尼考（FFC）。接合子blaCTX-M基因的檢測方法同1.3。

2 結果與分析

表1 29株產ESBLs大腸桿菌中blaCTX-M基因亞型

2.1 產ESBLs雞源大腸桿菌中blaCTX-M基因的檢測 使用超廣譜β-內酰胺酶基因（blaCTX-M-1群、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-2群）引物對29株產ESBLs雞源大腸桿菌的基因組DNA進行PCR擴增，結果（見表1）顯示：29株大腸桿菌中，CTX-M型ESBLs的檢出率為100%；經測序比對，29株菌中共檢測出7種CTX-M基因亞型，其中blaCTX-M-65亞型的數量最多（8個），分離率為27.6%；其次為 blaCTX-M-55（7 個）、blaCTX-M-14（5 個）、blaCTX-M-79（5個）、blaCTX-M-27（2個）、blaCTX-M-15（1個）、blaCTX-M-123（1個）。

2.2 blaCTX-M基因陽性雞源大腸桿菌質粒的接合試驗 試驗結果顯示，受體菌和供體菌在雙抗選擇培養基上均無菌落生長。29株產ESBLs雞源大腸桿菌與大腸桿菌C600接合，經TSA雙抗平板（400 μg/mL利福平和4μg/mL頭孢噻肟）篩選，共獲得11株接合子，接合轉移發生率為37.9%（11/29）；29株菌的接合效率均在10-5～10-3之間（見表2）。

表2 供體菌和接合子的耐藥表型及blaCTX-M基因型比較、接合效率

2.3 供體菌和接合子的耐藥表型及blaCTX-M基因型比較 對11株接合成功的大腸桿菌進行10種抗菌藥物的耐藥表型檢測，結果顯示：所有的接合子均對頭孢噻肟（CTX）有耐藥性，部分接合子對頭孢他啶（CAZ）、復方新諾明（SXT）、多西環素（DO）、氟苯尼考（FFC）中的一種或幾種具有耐藥性；11株接合子中有3株接合子為多重耐藥菌；與供體菌相比，100%接合子的耐藥譜變窄（表2）。

以篩選出的接合子總DNA為模板，對耐藥基因blaCTX-M進行PCR擴增、測序比對，結果顯示：接合子的CTX-M基因型與相應供體菌一致，表明該耐藥基因確實是通過質粒轉移水平傳播的。

3 討論

近年來畜牧養殖業中超廣譜β-內酰胺類抗菌藥的大量使用已成為普遍現象[5]，食品動物源產ESBLs的革蘭氏陰性菌大量增加。目前CTX-M是全球分布最廣泛的ESBL，不僅在人類，而且在動物和環境中都廣泛流行。本研究從四川各地規模化雞場分離到29株產ESBLs的大腸桿菌，均為blaCTX-M基因陽性，絕大部分屬于4種基因亞型：blaCTX-M-65型、blaCTX-M-55型、blaCTX-M-14型和 blaCTX-M-79型。

接合轉移是DNA水平傳播的最主要的機制之一，在耐藥基因的傳播中具有重要作用。本研究中11株雞源大腸桿菌的blaCTX-M耐藥基因可以通過接合水平轉移，導致耐藥基因傳播，而且接合成功率和接合效率均較高。另外18株菌不能通過接合傳遞，表明這些耐藥基因可能存在于染色體上，也可能存在于某些不能在同種或不同種屬細菌間接合轉移的質粒上。由藥敏試驗結果可知，11株接合子中有3株為多重耐藥菌，對其他類型抗菌藥也表現出了耐藥性，提示耐這些藥物的基因也隨著含有blaCTX-M的接合性質粒而傳遞，這些耐藥基因很可能位于同一質粒上。

在規模化雞場，用于治療大腸桿菌引發呼吸道感染的抗菌藥中，只有氨基糖苷類抗菌藥和β-內酰胺類抗菌藥中的頭孢菌素能有效治療。用于治療大腸桿菌感染的抗菌藥種類有限，必然會對雞體內的大腸桿菌長期施加相對單一的抗生素選擇壓力，進而導致大腸桿菌分離株中出現大量的抗β-內酰胺類藥物的菌株。近幾年產blaCTX-M菌株的分離率逐漸升高，就是由于blaCTX-M可以通過接合在不同菌株間傳播，以及β-內酰胺類抗生素的選擇壓力所致。動物源耐藥菌的增多，不僅增加了臨床上治療用藥的難度，而且有傳播到人類呼吸道及腸道的潛在威脅。因此，對質粒介導耐藥基因的水平傳播進行監測，對于嚴格規范抗菌藥使用、減少多重耐藥菌出現具有重要意義。

[1]李永清，甘孟侯.禽大腸桿菌病防制研究進展[J].中國獸醫學報，2000，20（4）：414-416.

[2]常洪美.2005～2008年臨床常見細菌耐藥性分析[J].現代預防醫學，2009，36（19）：3718-3720.

[3]Eckert C，Gautier V，Saladin-Allard M，et al.Dissemination of CTX-M-type β-lactamases among clinical isolates of Enterobacteriaceae in Paris，France[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2004，48（4）：1249-1255.

[4]Clewell D B，An F Y，White B A，et al.Sexpheromones and plasmid transfer in Streptococcus faecalis：apheromone，cAM373，which is also excreted by Staphylococcus aureus[J].Basic Life Sciences，1985，30（5）：489-503.

[5]應永飛.濫用獸藥是自毀養殖“長城”——畜禽產品的獸藥殘留問題及其解決對策[J].中國動物保健，2008（3）：21-26.