β-內(nèi)啡肽基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)的生物效應(yīng)研究

李星 ，白光明 *，萬小平 *，程馳 ，李江淩 ，呂學(xué)斌 ，王澤洲 ，高榮 **

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省動(dòng)物疫病預(yù)防與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.四川理工學(xué)院生物工程系，四川 自貢 643000；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；4.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

β-內(nèi)啡肽（β-endorphin，EP）由 31個(gè)氨基酸組成，可由動(dòng)物下丘腦-垂體自身合成[1]。通常情況下僅少量釋放到血液中，在應(yīng)激情況下釋放入血增多，發(fā)揮重要的抗應(yīng)激和抑制疼痛的效應(yīng)[2]。近來發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)也能夠產(chǎn)生β-內(nèi)啡肽，主要是外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）合成的，PBMC主要包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，其中T型記憶細(xì)胞中β-內(nèi)啡肽含量比較高。在炎癥或者應(yīng)激情況下，PBMC中的β-內(nèi)啡肽含量會(huì)顯著升高，然而血漿中的β-內(nèi)啡肽含量并未發(fā)生變化。有研究表明淋巴結(jié)中的β-內(nèi)啡肽含量要顯著高于血漿，說明β-內(nèi)啡肽在免疫細(xì)胞中合成后被送到淋巴結(jié)中[3]。β-內(nèi)啡肽是由促阿黑皮素原的前體POMC加工形成的，曾在免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有全長表達(dá)的mRNA，只是mRNA要比垂體中的mRNA短約200 bp，并且沒有信號肽序列。說明β-內(nèi)啡肽在PBMC中的分泌形式同細(xì)胞因子十分相同，不需要信號肽前體就能分泌釋放[4]。小鼠的下丘腦中很多β-內(nèi)啡肽都具有生物學(xué)活性[5]。

對于β-內(nèi)啡肽在免疫方面的作用有很多報(bào)道，效應(yīng)不一，主要表現(xiàn)為抑制作用。動(dòng)物生產(chǎn)和運(yùn)輸中，動(dòng)物的應(yīng)激不僅導(dǎo)致其生長和生產(chǎn)性能下降，而且持續(xù)的應(yīng)激可造成免疫抑制，降低抗病能力，容易感染病原發(fā)病；同時(shí)減弱動(dòng)物對疫苗的免疫應(yīng)答，致使其免疫保護(hù)力降低、保護(hù)期縮短。除傳統(tǒng)的飼養(yǎng)管理措施和化學(xué)藥物外，目前迫切需要新技術(shù)來控制或減少動(dòng)物應(yīng)激發(fā)生，因此，本研究進(jìn)一步探索了β-內(nèi)啡肽的生物學(xué)效應(yīng)。我們利用殼聚糖及其修飾分子包裹β-內(nèi)啡肽重組基因質(zhì)粒，制備納米顆粒劑肌肉注射實(shí)驗(yàn)小鼠，同時(shí)用重組畢赤酵母菌進(jìn)行灌胃口服，比較探索β-內(nèi)啡肽基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)的抗應(yīng)激和免疫生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真核載體質(zhì)粒、畢赤酵母和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 β-內(nèi)啡肽基因（EP）的重組VR1020表達(dá)質(zhì)粒-VREP：由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；VR1020：真核表達(dá)質(zhì)粒，美國Vical公司提供，由本單位實(shí)驗(yàn)室保存；β-內(nèi)啡肽基因的重組酵母表達(dá)載體pGAPZαA-EP：由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；3周齡18～20 g健康雌性昆明小白鼠：由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 Fluorescein isothiocyanate（FITC）antimouse CD4 和 Phycoerythrin（PE） anti-mouse CD8a（Lγ-2）：均購于 eBioscience公司；多聚磷酸鈉：購自天津市海晶精細(xì)化工廠；IgG、IgG1、IgG2a ELISA試劑盒：購自R&D公司；EDTA-K2：購自科龍?jiān)噭┕尽?.1.3 包裹用納米材料 殼聚糖（CS，MW：15KD，脫乙酰度95%）：購自Sigma-Alorich公司；mPEG-PEICS（聚乙二醇和乙烯亞胺修飾的殼聚糖分子）：由四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院李瑛老師于實(shí)驗(yàn)室合成。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的大量制備 真核重組大提質(zhì)粒大提具體步驟（參照Omega無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒）：內(nèi)毒素檢測依據(jù)鱟試劑凝膠法說明書進(jìn)行。重組質(zhì)粒和VR1020質(zhì)粒的內(nèi)毒素含量均低于標(biāo)準(zhǔn)值（0.1E/mg）。

1.2.2 納米顆粒的制備 用離子交聯(lián)法制備質(zhì)粒DNA殼聚糖納米顆粒[6]。

1.2.3 畢赤酵母菌體準(zhǔn)備 接種已構(gòu)建正確的含有重組質(zhì)粒pGAPZαA和 pGAPZαA-EP的畢赤酵母至YPD培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)36 h，室溫下4000r/min離心5min，用新鮮培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)節(jié)菌液濃度至每0.3mL菌液含108個(gè)酵母細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將50只18～20g的3周齡雌性昆明小白鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。分組及處理見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠分組及處理

1.2.5 小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量測定 注射納米顆粒及灌胃之前首次采血，注射及灌胃后每周固定時(shí)間采尾靜脈血一次，用血球自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行血常規(guī)檢測。

1.2.6 EP對小鼠生長的影響 50只小鼠分組后，試驗(yàn)前分別稱取每組小鼠的體重，以后每周固定時(shí)間稱取小鼠體重，觀察小鼠生長變化。

1.2.7 CD4+、CD8+T細(xì)胞的檢測 免疫后14d、28d采集實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈抗凝血，用以檢測CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的變化。每組分別加入FITC和PE分子標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4+、CD8+T單克隆抗體。用Coulter流式細(xì)胞儀分析小鼠血液CD4+、CD8+T細(xì)胞群的變化。

1.2.8 免疫小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a含量的測定 小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒測定小鼠外周血血清中的IgG、IgG1、IgG2a、β-內(nèi)啡肽以及皮質(zhì)醇的含量。

1.2.9 免疫相關(guān)基因的定量PCR檢測 免疫相關(guān)基因的定量PCR表達(dá)分析用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行。以免疫小鼠血細(xì)胞cDNA為模板，根據(jù)表2中的定量引物進(jìn)行擴(kuò)增。

表2 免疫相關(guān)基因的擴(kuò)增引物

所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用方差分析進(jìn)行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒的形態(tài)、粒徑及Zeta電位 4種納米顆粒在SEM觀察并拍照，納米顆粒大小與預(yù)期相同。SEM圖片見圖1、圖2。

利用Zeta sizer分析儀檢測納米顆粒的粒徑及Zeta電位，得出納米顆粒平均粒徑大小均在100～230nm之間，其中所有的納米顆粒都帶正電荷，合乎轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)基因的要求。

2.2 凝膠阻滯分析 用材料CS、mPEG-PEI-CS包裹質(zhì)粒VREP，形成的納米顆粒利用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示：包裹好的納米顆粒完全阻滯在點(diǎn)樣孔，沒有溢出。說明質(zhì)粒已被殼聚糖分子充分包裹形成了納米顆粒。

2.3 小鼠體重變化情況 試驗(yàn)前、后每周采血前定時(shí)稱量小鼠體重，觀察生長變化情況。由圖3可知：第7d～21d，注射 VREP-CS、VREP-PEG-PEI-CS 的小鼠的生長速度顯著高于對照組（P＜0.05），28d后這兩組小鼠的生長速度逐漸減緩，35 d時(shí)這兩組小鼠的體重與對照組差異不顯著（P＞0.05）。說明注射組小鼠在試驗(yàn)前期的進(jìn)食量可能要高于對照組，這與β-內(nèi)啡肽能夠在短期內(nèi)增加食欲的作用是一致的。而酵母口服試驗(yàn)組和對照組小鼠的體重差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 VREP-CS約 100～200nm

圖2 VREP-mPEG-PEI-CS約 50～100nm

圖3 實(shí)驗(yàn)小鼠免疫后體重的變化情況

2.4 CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的數(shù)量變化 用流式細(xì)胞儀分析小鼠血液中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的比例變化。由圖4可知：免疫后14d和28d，注射VREPCS、VREP-PEG-PEI-CS納米顆粒的試驗(yàn)組及酵母口服組的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例與對照組相比均有顯著增加（P＜0.05）；但此期注射VR1020裸質(zhì)粒和口服酵母空載體，這兩組小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞所占比例差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 小鼠CD4+、CD8+T細(xì)胞含量變化

2.5 IgG、IgG1、IgG2a含量測定 由圖5可知：從第7 d到28d，注射組免疫小鼠的血清IgG含量均較對照組小鼠有明顯升高（P＜0.05）；從第7 d開始，口服組小鼠的血清IgG含量與對照組相比均有明顯升高（P＜0.05），說明試驗(yàn)組小鼠的體液免疫水平較對照組顯著提高。從第7d到35d，所有小鼠的血清IgG1、IgG2a含量與對照組相比均無明顯上升（P＞0.05）。

2.6 免疫小鼠血清β-內(nèi)啡肽含量測定 β-內(nèi)啡肽是免疫系統(tǒng)應(yīng)答和應(yīng)激的介質(zhì)[7]。由圖6可知：實(shí)驗(yàn)小鼠從第7d到21d，血清中的β-內(nèi)啡肽含量逐漸增加，與對照組差異顯著（P＜0.05）；第 21d后，試驗(yàn)組與對照組的差異逐漸縮小。說明體內(nèi)β-內(nèi)啡肽含量從第0d開始逐漸增加，第21d時(shí)達(dá)到最高峰，之后又逐漸減少，可能是接種質(zhì)粒的表達(dá)效應(yīng)減弱所致。

2.7 免疫小鼠血清皮質(zhì)醇含量測定 機(jī)體內(nèi)很多激素類物質(zhì)通常能夠客觀地反映應(yīng)激對機(jī)體的影響程度，應(yīng)激情況下機(jī)體的生理反應(yīng)通常表現(xiàn)在體內(nèi)皮質(zhì)醇含量增加[8]。由圖7可知：第14d時(shí)，注射VREPCS、VREP-PEG-PEI-CS的免疫小鼠，其血清中的皮質(zhì)醇含量最高，其余時(shí)期皮質(zhì)醇含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖5 實(shí)驗(yàn)小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a含量變化

2.8 免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的變化 試驗(yàn)測得：接種后 7d 開始，TLR1、TLR4、TLR6、TLR9、TGF-β、IL-1、IL-23這7種基因的表達(dá)水平相比對照組均有顯著提高（P＜0.05）（重組質(zhì)粒組7d和mPEG-PEI-CS組的IL-1例外），說明接種重組質(zhì)粒及重組酵母菌均能激發(fā)這幾種基因的表達(dá)。除TLR6外，其他6種基因的表達(dá)量均在免疫后21d達(dá)到最高峰；而TLR6基因在免疫后7d達(dá)到最高表達(dá)量，之后逐漸降低。

圖6 實(shí)驗(yàn)小鼠血清β-內(nèi)啡肽含量變化

圖7 實(shí)驗(yàn)小鼠血清皮質(zhì)醇含量變化

4 結(jié)論與分析

相關(guān)研究表明，β-內(nèi)啡肽對免疫系統(tǒng)有抑制作用。阿片肽受體拮抗物——納洛酮和納曲酮能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，絲裂原能誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞以及脾細(xì)胞在幾分鐘之內(nèi)出現(xiàn)增殖反應(yīng)[9]。阿片肽受體拮抗物還能使實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎的病情惡化，然而外界應(yīng)激刺激在增加外周血單核細(xì)胞中β-內(nèi)啡肽含量的同時(shí)，卻能夠抑制該病情的進(jìn)一步惡化[10]。

本試驗(yàn)利用殼聚糖改性分子包裝質(zhì)粒VREP，肌肉注射小鼠，并利用重組酵母菌灌胃小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射組和口服組小鼠均能在短期內(nèi)增加食欲，進(jìn)而增加體重；對小鼠外周血中的白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞及血紅蛋白的含量影響不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)組小鼠血清中的IgG含量顯著升高，IgG1和IgG2a含量與對照組差異不顯著（P＞0.05）；接種小鼠從第7d到21d，血清中的β-內(nèi)啡肽含量較對照小鼠明顯增加，體內(nèi)β-內(nèi)啡肽含量的升高，反映其抗應(yīng)激能力增強(qiáng)，且這些小鼠均未觀察到任何局部病變或炎癥損傷。由此說明試驗(yàn)組的體液免疫水平明顯上升，抗應(yīng)激能力提高；且重組質(zhì)粒注射或重組酵母口服均對動(dòng)物無不良影響。

Toll樣受體（TLR）、IL-23、TGF-β 在啟動(dòng)抗微生物病原體免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥組織修復(fù)、細(xì)胞生長分化以及免疫調(diào)節(jié)等方面起著關(guān)鍵作用。免疫后7d開始，重組質(zhì)粒納米顆粒及重組酵母菌會(huì)激發(fā)7種免疫相關(guān)基因的表達(dá)，使其表達(dá)水平相對于接種前均顯著提高（P＜0.05），提示接種后產(chǎn)生了較好的先天性免疫和獲得性免疫增強(qiáng)效應(yīng)。

總之，本試驗(yàn)表明β-內(nèi)啡肽基因重組質(zhì)粒納米顆粒和重組酵母菌可提高實(shí)驗(yàn)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫水平，增強(qiáng)機(jī)體抗應(yīng)激能力。這為進(jìn)一步探索β-內(nèi)啡肽在動(dòng)物抗應(yīng)激及其免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定了基礎(chǔ)，也為研發(fā)安全高效的抗應(yīng)激生物制劑提供了新的科學(xué)依據(jù)，在商業(yè)化應(yīng)用方面具有潛在價(jià)值。

[1]Li C H，Chung D.Isolation and structure of an untriakontapeptide with opiate activity from camel pituitary glands[J].Proc Natl Acad Sci，1976，73（4）：1145-1148.

[2]胥俊峰，王松.β-內(nèi)啡肽的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國綜合臨床，2000，16（4）：255-256.

[3]Sharp B，Yaksh T.Pain killers of the immune system[J].Nat Med，1997，3（8）：831-832.

[4]Panerai A E，Sacerdote P.β-endorphin in the immune system：a role at last?[J].Immune Today，1997，18（7）：317-319.

[5]Emeson R B，Eipper B A.Characterization of pro-ACTH/endorphin-derived peptides in rat hypothalamus[J].J Neurosci，1986，6（3）：837-849.

[6]白光明，羅公明，王曄，等.豬β-內(nèi)啡肽基因克隆和重組質(zhì)粒殼聚糖修飾分子包裝體外表達(dá)研究[J].四川動(dòng)物，2013，32（1）：44-50.

[7]Sunil Kumar，Soma M G，Umesh Rai，et al. β-Endorphin inhibits phagocytic activity of lizard splenic phagocytes through μ receptor-coupled adenylate cyclase-protein kinase A signaling pathway[J].General and Comparative Endocrinology，2011，171（3）：301-308.

[8]Fazio E，Medica P，Grasso L，et al.Changes of circulating β-endorphin， adrenocorticotrophin and cortisol concentrations during growth and rearing in Thoroughbred foals[J].Livestock Science，2009，125：31-36.

[9]Manfredi B，Sacerdote P，Bianchi M，et al.Evidence for an opioid inhibitory tone on T-cell proliferation[J].J Neuroimmunol.1993，44：43-48.

[10]Kuroda Y，Mori T，Hori T.Restraint stress suppresses experimental allergic encephalomyelitis Lewis rats[J].Brain Research Bulletin，1994，34（1）：15-17.