泌尿生殖道支原體固體培養基的研制及臨床應用

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(江門市皮膚醫院，廣東 江門 529000)

支原體是一類缺乏細胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、在無生命培養基中能生長繁殖的最小原核細胞型微生物[1]。目前引起人類泌尿生殖道感染的主要有解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum,Uu)、人型支原體(Mycoplasma hominis, Mh)、生殖支原體(M. genitalium, Mg)與穿透支原體(M. penetrans, Mpe)[2-4]。隨著支原體引起的泌尿生殖道感染的發病率增高，亟待研制一種快速、準確的支原體培養基與培養方法。目前，國內對泌尿生殖道支原體的臨床檢測多數采用液體培養法，這一方法已延用20多年，但臨床實踐中已暴露出諸多缺點。支原體在固體培養基上形成的特征性菌落是泌尿生殖道感染的直接證據，沒有假陽性存在，是一種較科學的檢測手段。為此，本文旨在研制一種適合臨床檢測泌尿生殖道支原體的固體培養基和培養方法并進行初步的臨床應用。

1 材料與方法

1.1標準菌株Uu標準株(ATCC27813)和Mh標準株(ATCC15488)由南華大學病原生物學研究所惠贈。

1.2支原體培養基的配制

1.2.1 自制支原體培養基 在基礎肉湯上增加1%的蛋白胨，并用25%新鮮酵母配制，用1 mol/L NaOH調pH至6.5，8磅高壓滅菌30 min，待冷卻后加入終濃度分別為20%小牛血清、0.1%尿素、0.1%精氨酸，0.002%酚紅、100 μg/mL萬古霉素、3 μg/mL兩性霉素及50 μg/mL多粘菌素B等，分裝試劑盒，每支1.5 mL。在此基礎上，在無菌條件下加入0.9%的瓊脂，并傾注5 cm平皿即固體培養基。4～8 ℃保存備用。

1.2.2 對照培養基 選用IST2支原體分離、鑒定、藥敏試劑盒(法國梅里埃公司批號：1005926020)和A7支原體固體培養基(法國梅里埃公司批號：1005665600)。

1.3檢測對象收集本院性病科門診2017年1月～6月的檢測標本，共594例，其中男性415例，女性179例。年齡19～57歲，平均31.7±5.7歲。所有患者均有尿道炎癥狀或宮頸炎癥狀。其中男性主要表現為尿頻、尿急、尿道口稀薄分泌物、腹部下墜痛等癥狀；女性主要表現為陰道分泌物異常(增多、顏色發黃、有異味、膿性或血性等)、外陰瘙癢、下腹痛等癥狀。

1.4檢測方法接種：常規用無菌棉拭取材，男性患者取尿道拭子，女性患者取宮頸拭子。取材后立即接種于自制支原體雙相液體培養基與梅里埃IST2肉湯中，分別取60 μL分3滴滴加于自制的固體培養基與A7支原體固體培養基表面[5]，置37 ℃恒溫培養箱中放置10～20 min，待液面干后將培養皿倒置放于37 ℃的CO2培養箱中進行培養，并分別于16 h、20 h、24 h、36 h、48 h時間段觀察兩種液體培養基顏色變化單位(color changing unit，CCU)，同時用顯微鏡于低倍鏡下觀察兩種固體培養基的菌落形成單位(colony forming unit，CFU)并觀察支原體菌落形態。大于48 h液體培養基澄清不變色且固體培養基上無支原體菌落生長者視為陰性，并記錄結果。

1.5統計學方法采用SPSS 18.0軟件進行數據處理，一致性檢驗采用κ值表示：極好的一致性(0.81<κ<1.0)，高度一致性(0.61<κ<0.8)，中度一致性(0.41<κ<0.6)，一致性差(0.81<κ<1.0)，無意義(κ<0)。率的比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1標準株檢測結果標準株在梅里埃IST2肉湯、A7固體培養基和自制支原體雙相液體、固體培養基中均能生長。梅里埃IST2肉湯CCU為20 h，而自制支原體雙相液體培養基CCU小于16 h；梅里埃A7固體培養基CFU(≥104)為24 h，自制支原體固體培養基CFU(≥104)小于16 h。

2.2自制液體和固體培養基有較高的質量標本接種16 h時，自制支原體液體和固體培養基與對照組梅里埃試劑IST2和A7培養基的陽性率分別為8.92%(53/594)和3.70%(22/594)，20 h培養的陽性率分別為21.38%(127/594)和13.30%(79/594)，自制支原體培養基在16 h和20 h的陽性檢出率均明顯優于對照組梅里埃試劑(χ2=13.68，P<0.01；χ2=13.53，P<0.01)。自制固體培養基上長出的菌落有92.27%于16 h～24 h之間可辨認。48 h培養后，594例臨床標本中梅里埃IST2和自制雙相液體培養基混濁生長分別有7例和14例，這兩種液體培養基的抑菌率分別為98.82%(587/594)和97.64%(580/594)，抑菌效果基本一致。

2.3自制固體培養基與A7培養基有較好的一致性以鏡下固體培養基上的典型支原體菌落形態作為陽性判斷標準(圖1)，梅里埃A7培養基培養陽性192例，自制支原體固體培養基陽性194例，結果見表1。以梅里埃A7培養基作為“金標準”，如表2所示：自制支原體固體培養基的敏感性為97.92%(188/192)，特異性為98.51%(396/402)，經卡方檢驗，兩者差異無顯著性(χ2=0.10，P>0.05)，κ值為0.96，即自制固體培養基與A7培養基有較好的一致性。

表1 梅里埃與自制培養基鑒定594例臨床標本中支原體效果比較

a：培養時間大于48 h且培養基混濁變紅色；b：培養時間大于48 h且培養基混濁不變色；c：培養時間大于48 h培養基澄清不變色

表2 梅里埃A7與自制固體培養基的培養結果比較

圖1 支原體在自制支原體固體培養基上的菌落形態(10×)A：Uu，呈棕黑色海膽樣菌落；B：Mh，呈無色油煎蛋樣菌落；C：Uu與Mh混合生長

3 討 論

解脲脲原體(Uu)和人型支原體(Mh)是泌尿生殖道感染較為常見的病原體，對于這兩種支原體的檢測，常規采用Uu和Mh單相液體培養基，經培養后通過觀察液體CCU來診斷，但是單相液體培養基的CCU無法真正將Uu和Mh從送檢標本中分離出來，液體培養基主要通過添加不同底物使其發生生化反應對其作出間接判斷，若送檢標本的雜菌多，使抑菌劑無效，從而容易造成培養污染、假陰性或假陽性等結果。所以，根據國內外學者的普遍意見，固體培養是判斷標本中有無支原體存在的金標準方法，固體培養具有液體培養無可替代的優勢：其一是根據典型菌落形態可以作出直接判斷，不會出現假陽性結果，即使固體培養基有輕度污染也不會影響支原體生長及觀察；其二是根據菌落形態和出現時間可以在固體培養基上同時鑒別多種支原體，并能進行純培養，用于后續研究[6]。目前，國內醫院檢驗科常用市售的液體雙相培養基進行分離和鑒定支原體，同時附以藥敏板聯合培養，以便更快地幫助患者明確診斷和盡早應用敏感的抗生素治療[7]。支原體在液體中生長，Uu分解尿素，Mh分解精氨酸，均使液體培養基顏色由黃變紅，進而鑒別支原體。由于泌尿生殖道內含有多種微生物，有些微生物同樣可分解尿素或精氨酸，從而使培養基顏色變紅并出現渾濁或沉淀，若僅依據顏色改變可增加假陽性或假陰性率。另外，液體培養只是一種生化鑒定，無法準確判斷有無支原體生長，且同一種液體培養基通常無法同時判斷兩種以上支原體生長，所以進行支原體固體培養基研制和應用具有臨床診斷意義。

鑒于國內臨床實踐中出現的問題及微生物學對診斷的要求，為此，本文旨在研究一種適合臨床檢驗用的固體培養基和培養方法。支原體雙相培養基要提高支原體陽性檢出率，必須注重微生物的生態環境，如培養基的營養成分、pH值、抑菌劑及指示劑的選擇等。本文借鑒公認的A7配方[8-9]，增加了蛋白胨、小牛血清含量，同時添加了DMEM，并用25%新鮮酵母配制。將傳統培養基中的抑菌劑青霉素改為萬古霉素、兩性霉素及多粘菌素B，能有效地抑制革蘭陽性細菌、革蘭陰性細菌及真菌生長，防止雜菌污染。由于支原體屬于無細胞壁微生物，所以臨床通常選用β-內酰胺類抗生素(如青霉素)來抑制具有細胞壁的雜菌，但是青霉素在水溶液中不穩定，抗菌譜狹窄，耐藥菌株多，在低濃度的水溶液中易分解，加之泌尿生殖道雜菌多，特別是耐藥的葡萄球菌大量存在，致使培養基污染長菌，抑制了支原體的生長。

本研究從表1數據可知，16 h內生長且鏡下可見典型菌落的梅里埃A7培養基有22株，而自制固體培養基有53株；20 h內生長且鏡下可見典型菌落的梅里埃A7培養基有79株，而自制固體培養基有127株，支原體在自制培養基中16 h和20 h的生長速度明顯優于梅里埃培養基(χ2=13.68，P<0.01；χ2=13.53，P<0.01)。經48 h培養后，培養基混濁提示有細菌生長，梅里埃IST2有7例，自制雙相液體培養基有14例，自制雙相液體培養基抑菌效果達97.64%。若以鏡下的典型支原體菌落形態作為陽

性判斷標準，梅里埃A7培養基培養陽性有192例，自制支原體固體培養基陽性194例。以梅里埃A7培養基作為“金標準”，自制支原體固體培養基的敏感性為97.92%，特異性為98.51%，兩者差異無顯著性(χ2=0.10，P>0.05)，說明自制的支原體固體培養基分離Uu和Mh的效果顯著，Uu和Mh在這種培養基上均能夠生長良好，為一種培養基上同時分離Uu和Mh兩種支原體提供了良好技術支持，較液體培養更具有科學性臨床意義和應用價值。

總之，本研究生產的液體和固體培養基有其自身特點，將自制的支原體固體培養基用于Uu和Mh分離，可獲得與生物梅里埃A7固體培養基和IST2同樣的效果，支原體菌落生長速度快，且來源方便、價格低廉，適合基層單位開展支原體檢測和診斷。

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