南海4個(gè)花刺參地理群體的遺傳多樣性研究

文 菁，范嗣剛，李海鵬，胡超群

( 1.嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300； 3.廣州大學(xué)，廣東 廣州 510006； 4.中國科學(xué)院 南海海洋研究所，熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510301 )

海參是一種珍貴的海產(chǎn)品，長期以來受到亞洲人民的喜愛。我國有約140種海參，可食用的約有20種[1]。花刺參(Stichopusmonotuberculatus)俗稱“黃肉參”，個(gè)體大、肉質(zhì)軟糯，是重要的食品和醫(yī)藥原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。目前花刺參已成功突破人工繁育和幼苗養(yǎng)殖[2]，有望成為華南沿海地區(qū)養(yǎng)殖的新品種。目前有關(guān)花刺參的研究，主要有花刺參繁育[2]、種類鑒定與區(qū)分[3-4]、免疫[5-6]、養(yǎng)殖模式[7]、營養(yǎng)及化合物開發(fā)等方面[8-9]。

線粒體DNA序列具有結(jié)構(gòu)簡單、重組率低、進(jìn)化速度快和復(fù)制數(shù)多等特征，已廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的遺傳多樣性研究[10-11]。在海參中，Skillings等[12]用cox1研究了19個(gè)黑海參(Holothuriaatra)群體的遺傳多樣性。Vergara-Chen等[13]用cox1和16S分析了5個(gè)H.polii的遺傳多樣性。So等[14]用cox1分析了20個(gè)北大西洋海參(Cucumariafrondosa)的遺傳結(jié)構(gòu)。Uthicke等[15]用cox1分析了24個(gè)黑乳海參(H.nobilis)的遺傳多樣性。Arndt[16]用12S研究了11個(gè)Cucumariapseudocurata群體和5個(gè)C.miniata群體的遺傳結(jié)構(gòu)。

文獻(xiàn)記載花刺參在我國海南島和廣西潿洲島有分布[1]。筆者在廣西潿洲島，海南臨高、三亞和瓊海采集到數(shù)目不等的花刺參個(gè)體，利用線粒體cox1基因序列分析這4個(gè)花刺參野生群體的遺傳多樣性，探討其群體關(guān)系，為花刺參的種質(zhì)資源保護(hù)和管理提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2008—2009年，在潿洲島和海南島捕撈獲得花刺參野生個(gè)體(體長20～50 cm)，其中潿洲島采集到22個(gè)，群體命名為潿洲島，海南臨高采集了18個(gè)，瓊海15個(gè)、三亞28個(gè)(圖1)，共計(jì)83個(gè)個(gè)體。海參采集后，剪取每個(gè)個(gè)體的背部肌肉組織，用100%無水乙醇保存后帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

剪取海參樣品體壁組織約30 mg用雙蒸水洗凈, 滅菌吸水紙吸干水分。用海洋生物DNA提取試劑盒(TIANGEN，中國)提取DNA：體壁剪碎后，55 ℃水浴消化12 h后轉(zhuǎn)移到柱子，去蛋白，洗脫，50 μL TE溶解，離心后得到DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 4個(gè)花刺參群體取樣地點(diǎn)

花刺參線粒體cox1基因擴(kuò)增引物為：COIef(5′-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3′)和COIer(5′-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3′)[16]。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s隨后35個(gè)循環(huán)，94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃ 60 s; 最后72 ℃10 min。反應(yīng)體系為50 μL：15 mmol/L MgCl2、100 μmol/L dNTPs、0.2 μmol/L正(反)引物、1 μLDNA模板、2 U Taq DNA聚合酶(Takara，日本)，ddH2O補(bǔ)平50 μL。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA膠回收試劑盒(Takara，日本)對目的片段進(jìn)行回收，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Mega 7.0對所有序列進(jìn)行比對。用Dnasp 4.0軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型多態(tài)性、核苷酸多態(tài)性和平均核苷酸差異數(shù)。用Mega 7.0的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算群體間的遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用鄰接法來構(gòu)建各單倍型間的鄰接進(jìn)化樹。鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹均進(jìn)行1000次的自舉，計(jì)算分支支持率。使用軟件Network 4.5構(gòu)建單倍型主干網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。利用軟件Arlequin 3.01中的分子方差分析計(jì)算群體間和群體內(nèi)的差異，通過1000次重復(fù)抽樣來檢驗(yàn)不同遺傳結(jié)構(gòu)水平上協(xié)方差的顯著性，采用分化固定指數(shù)來評估群體間的遺傳分化程度，通過1000次重復(fù)取樣來檢驗(yàn)群體間分化固定指數(shù)的顯著性，采用Tajima′s D值進(jìn)行中性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)分析

所分析的花刺參4個(gè)群體中83個(gè)個(gè)體的cox1基因部分序列長665 bp。在這665個(gè)位點(diǎn)中，檢測到保守位點(diǎn)631個(gè)(94.89%)、多態(tài)性位點(diǎn)有34個(gè)(5.11%)，其中31個(gè)為簡約信息位點(diǎn)，3個(gè)為單突變位點(diǎn)，共檢測到23個(gè)單倍型，其中共享單倍型有6個(gè)，約為26.09%(6/23)。23個(gè)cox1單倍型序列的GenBank登陸號為KC424496KC424518。單倍型H1和H4在個(gè)群體中均有分布。有38個(gè)個(gè)體表現(xiàn)為H1；有16個(gè)個(gè)體表現(xiàn)為H4。H6分布在3個(gè)群體中，有4個(gè)個(gè)體。H2分布在三亞和潿洲島群體中，H3分布在臨高和潿洲島群體中，H5分布在三亞和潿洲島群體中。其余17個(gè)單倍型均為群體特異單倍型，約為73.91%(17/23)。三亞群體的特異單倍型最多(9個(gè))，其次是瓊海群體(8個(gè))。臨高群體和潿洲島群體沒有特異單倍型。

4個(gè)群體83個(gè)個(gè)體的平均單倍型多樣性和平均核苷酸多樣性分別為0.75522和0.00780(表1)。瓊海群體的單倍型多態(tài)性值和核苷酸多態(tài)性值最高，分別為0.96190和0.01684。臨高群體的單倍型多態(tài)性值和核苷酸多態(tài)性值最低，分別為0.30719和0.00128。

應(yīng)用Tajima′s D值中性檢驗(yàn)推測種群曾經(jīng)歷的歷史時(shí)，如果Tajima′s D值呈負(fù)值，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到顯著標(biāo)準(zhǔn)，則說明序列中含有比中性進(jìn)化模型更多的核苷酸位點(diǎn)變化，可能預(yù)示著被研究種群曾經(jīng)經(jīng)歷過一個(gè)擴(kuò)張的歷史。在Tajima′s D統(tǒng)計(jì)中，臨高群體的D值為負(fù)(P<0.05)，說明臨高群體過去可能經(jīng)受過群體擴(kuò)張。潿洲島、三亞和瓊海的D值結(jié)果均不顯著(P>0.05)，符合中性進(jìn)化模型。

表1 個(gè)花刺參群體的遺傳多樣性參數(shù)

注：*P<0.05，顯著差異；n.s.，差異不顯著(P>0.05).下同.

2.2 群體間遺傳結(jié)構(gòu)分析

4個(gè)群體之間的分化固定指數(shù)和基因流見表2。三亞群體和瓊海群體之間，潿洲島群體和臨高群體之間均無遺傳分化(分化固定指數(shù)<0.05，P>0.05)。潿洲島群體和三亞群體之間的遺傳分化最小(分化固定指數(shù)=0.05942，P<0.05)，瓊海群體和臨高群體之間的遺傳分化最大(分化固定指數(shù)=0.33141，P<0.05)。臨高群體與潿洲島群體的基因流最頻繁(基因流=55.4910)，瓊海和臨高的基因流最小(基因流=1.0087)。4個(gè)花刺參地理種群的鄰接樹顯示，潿洲島群體和臨高群體聚在一起，然后再和三亞群體聚集，最外面為瓊海群體(圖2)。分子方差分析表明，群體內(nèi)個(gè)體間的變異為87.20%，是總變異的主要來源；群體間的遺傳變異有12.80%，說明花刺參野生群體間有中等遺傳分化(表3)。

表2 4個(gè)花刺參群體間的遺傳分化系數(shù)和基因流

注：對角線上為基因流值，對角線下為遺傳分化值.

圖2 4個(gè)花刺參群體基于線粒體cox1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

變異來源自由度平方和方差分量變異率/%群體間34.0740.0499712.80群體內(nèi)7926.8900.3403887.20共計(jì)8230.9640.39034

2.3 單倍型遺傳學(xué)關(guān)系

用Mega 7.0構(gòu)建單倍型的鄰接樹(圖3)。來自不同群體的23個(gè)單倍型劃分為2個(gè)主要分支。第一個(gè)分支包括16個(gè)單倍型，來自4個(gè)群體，第二個(gè)分支包括7個(gè)單倍型，來自瓊海和三亞2個(gè)群體，未發(fā)現(xiàn)明顯的地理譜系結(jié)構(gòu)。用Network構(gòu)建單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示的單倍型關(guān)系和鄰接樹的基本一致(圖4)。單倍型H1為最多共享單倍型，位于網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)展中心，可能是最原始的單倍型。

圖3 花刺參線粒體cox1基因單倍型鄰接樹

圖4 花刺參線粒體cox1單倍型間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

3 討 論

3.1 花刺參群體內(nèi)遺傳多樣性

衡量一個(gè)群體mtDNA變異程度的指標(biāo)主要是單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性。單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性的值越大，群體的遺傳多樣性越豐富。Vergara-Chen等[13]用cox1序列對海參H.polii的5個(gè)地理群體的遺傳多樣性進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.8734和0.0050。So等[14]用cox1序列對北大西洋海參20個(gè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行調(diào)查，單倍型多態(tài)性為0.849～1.000，核苷酸多態(tài)性值為0.0018～0.0085。Uthicke等[15]用cox1序列對24個(gè)黑乳海參群體的遺傳多樣性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示平均單倍型多樣性為0.942，平均核苷酸多樣性為0.0075。本研究所涉及的4個(gè)花刺參群體83個(gè)個(gè)體的平均單倍型多樣性為0.75522，比上述3種海參群體的低，平均核苷酸多樣性為0.00780，比H.polii和黑乳海參群體的高。4個(gè)花刺參群體中，瓊海群體的遺傳多樣性相對最豐富，臨高群體的遺傳多樣性相對最低。潿洲島、三亞和瓊海群體的遺傳多樣性水平表現(xiàn)為高單倍型多態(tài)性，低核苷酸多態(tài)性的特點(diǎn)(單倍型多態(tài)性>0.5，核苷酸多態(tài)性<0.05)。這種遺傳結(jié)構(gòu)一般是由一個(gè)較小的有效種群經(jīng)過近期快速成長為一個(gè)大的種群所引起的。群體的快速擴(kuò)張可產(chǎn)生許多新的突變，積累了單倍型的多樣性，但沒有足夠的時(shí)間來積累核苷酸序列的多樣性[13，17]。

3.2 花刺參各群體遺傳分化及相互關(guān)系

分化固定指數(shù)是亞群體間基因的分化比率。Weight[18]認(rèn)為，分化固定指數(shù)<0.05表示種群間沒有遺傳分化；0.05<分化固定指數(shù)<0.15表示種群間的遺傳分化程度中等；0.15<分化固定指數(shù)<0.25表示種群間有高度遺傳分化；而超過0.25時(shí)表示種群間的遺傳分化極大。一般來說，幼苗為有浮游期的海洋底棲生物，其不同地理群體間的遺傳結(jié)構(gòu)會很相似[14,19]。有研究表明，海參H.polii[13]、C.miniata[20]、北大西洋海參[14]和黑乳海參[15]不同地理群體之間遺傳分化很少，遺傳結(jié)構(gòu)相似。Skillings等[12]發(fā)現(xiàn)，在夏威夷群島周邊珊瑚礁的黑海參中，有些群體間尚未遺傳分化，有些群體間有遺傳分化，認(rèn)為黑海參群體間的地理距離和幼苗浮游路線是造成這種現(xiàn)象的原因。本研究結(jié)果與Skillings等[13]的研究結(jié)果相似。在花刺參個(gè)群體中，三亞群體和瓊海群體，潿洲島群體和臨高群體之間均沒有遺傳分化(分化固定指數(shù)<0.05，P>0.05)，但其他群體間均有不同程度的遺傳分化。

基因流，即每世代的平均遷移個(gè)體數(shù)是用來評判群體間基因流的參數(shù)。當(dāng)基因流>1，表明群體間的基因流的水平較高，群體間可通過某種渠道，發(fā)生基因交流；當(dāng)基因流>4時(shí)，種群間的基因交流頻繁；當(dāng)基因流<1時(shí)，基因流有限，一般認(rèn)為可能是有地理隔離的存在[21]。4個(gè)花刺參野生群體間的基因流均大于1，說明4個(gè)群體間都有基因流存在，沒有地理隔離。其中瓊海和臨高及潿洲島之間、臨高和三亞之間的基因流較少(1<基因流<4)。臨高和潿洲島群體間基因流最多，遺傳距離最近。單倍型的樹也表明不存在有地理譜系的單倍型。

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