血清雌激素水平和miR-365表達水平在非小細胞肺癌患者中的變化及其相關性研究

李樹坡，李鵬，余捍東，趙晶

肺癌是居于我國城鎮居民發病率第一位的惡性腫瘤，其發病率和病死率一直呈上升的趨勢，其中非小細胞肺癌（NSCLC）約占85%［1］。研究報道，NSCLC患者血清雌激素水平高于其他類型肺癌和正常人群［2］，經抗雌激素治療可顯著提高患者的生存率，提示血清雌激素水平在NSCLC的發生發展中可能發揮重要作用［3］。研究表明，微小RNA（miRNA）與腫瘤的發生發展、侵襲轉移等密切相關，其表達水平在腫瘤中表現為上調或者下調，同時伴隨相關功能的改變，提示miRNA在腫瘤的診斷和治療中具有較大的應用前景［4］。在與血清雌激素水平相關的腫瘤（乳腺癌）中，miR-365表達水平發生變化，并且與血清雌激素水平存在關聯［5］。與血清雌激素水平關系密切的NSCLC、miR-365表達水平如何，是否存在與乳腺癌類似的變化尚未見相關報道。本研究通過分析NSCLC患者血清雌激素水平與miR-365表達水平的變化及其相關性，以期為NSCLC的早期診斷和治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年3月—2016年4月在三峽大學附屬仁和醫院接受原發性NSCLC手術切除的57例患者作為NSCLC組，其中男35例，女22例；年齡47～73歲，平均年齡（59.5±5.8）歲；病理類型：腺癌31例，鱗狀細胞癌22例，腺鱗癌4例；TNM分期按照國際肺癌研究會（IASLC）公布的標準［6］，其中Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期24例。納入標準：為初次發現并在本院接受治療。排除標準：既往有內分泌、女性生殖系統疾病和其他系統腫瘤。選取同期本院體檢中心體檢健康者50例作為對照組，其中男38例，女12例；年齡46～70歲，平均年齡（57.7±6.4）歲。對照組經檢查均無肝、肺、腎、腦等疾病，無消化道和血液系統疾病史。本研究經三峽大學附屬仁和醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 雌二醇ELISA檢測試劑盒（美國Linco Research公司）；miScript反轉錄試劑盒與miScript SYBR Green PCR試劑盒（QIAGEN公司）；Trizol-LS（美國Invitrogen公司）；Smart Spec plus核酸蛋白檢測儀（美國 Bio-Rad公司）；Light Cycler 480Ⅱ基因擴增檢測儀（德國Roche公司）；引物由上海生工生物技術服務有限公司合成并修飾。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料收集 收集對照組性別、年齡，收集NSCLC組性別、年齡、吸煙（吸煙定義為20支/d，持續10年）情況、組織學類型、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況。

1.3.2 檢測血清雌激素水平 研究對象于清晨空腹抽靜脈血3～5 ml，3 000 r/min離心10 min（離心半徑5 cm），分離血清，吸取上清液后迅速置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測研究對象血清雌二醇水平，即血清雌激素水平。

1.3.3 實時熒光定量PCR（Real-time PCR）法檢測miR-365表達水平 采用Trizol-LS提取外周血中總RNA，采用miScript反轉錄試劑盒進行反轉錄成cDNA，用Smart Spec plus核酸蛋白檢測儀檢測OD260/280，計算miRNA的含量及純度。cDNA樣本置于-20 ℃冰箱保存備用。miR-365上游引物為5'-UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU-3'，下游引物為5'-AAGGAUUUUUAGGGGCAUUAUU-3'；內參U6的上游引物為 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。配成 25 μl反應體系，不足部分用H2O 補齊。Light Cycler 480Ⅱ基因擴增檢測儀設置的反應參數：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。采用相對標準曲線法計算miR-365表達水平，所有樣品均做3個復孔。

1.4 統計學方法 采用SPSS 15.0軟件進行數據分析。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；血清雌激素水平與miR-365表達水平的相關性分析采用Pearson相關分析；計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組性別、年齡比較 兩組研究對象性別、年齡比較，差異無統計學意義（χ2=1.89，P=2.38；t=1.35，P=0.18）。

2.2 血清雌激素水平比較 NSCLC組血清雌激素水平為（145±49）pmol/L，其中男性患者為（127±35）pmol/L，女性患者為（165±63）pmol/L；對照組血清雌激素水平為（87±38）pmol/L。NSCLC組血清雌激素水平高于對照組，差異有統計學意義（t=2.73，P=0.01）。在NSCLC組中，男性患者血清雌激素水平與女性患者比較，差異無統計學意義（t=1.87，P=0.07）。

2.3 兩組miR-365表達水平比較 NSCLC組miR-365表達水平為（0.57±0.43），對照組為（1.15±0.48）。NSCLC組miR-365表達水平低于對照組，差異有統計學意義（t=2.65，P=0.02）。

2.4 不同特征NSCLC患者miR-365表達水平比較不同性別、年齡、吸煙情況NSCLC患者miR-365表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。不同組織學類型NSCLC患者miR-365表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；鱗狀細胞癌、腺鱗癌NSCLC患者miR-365表達水平高于腺癌，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同分化程度NSLCL患者miR-365表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；低分化NSCLC患者miR-365表達水平低于高分化，差異有統計學意義（P＜0.05）。TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的NSCLC患者miR-365表達水平高于Ⅲ～Ⅳ期，差異有統計學意義（P＜0.05）。有淋巴結轉移的NSCLC患者miR-365表達水平低于無淋巴結轉移，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.5 NSCLC組血清雌激素水平與miR-365表達水平的相關性 NSCLC組血清雌激素水平與miR-365表達水平呈負相關（r=-0.57，P=0.02）。

3 討論

肺癌是非內分泌相關腫瘤，但越來越多的研究發現，血清雌激素水平與肺癌的發生發展存在關聯［2］。已有研究證實，血清雌激素水平可通過調節c-myc、c-fos等基因的表達，促進轉化生長因子、胰島素樣生長因子Ⅱ、與細胞周期有關的調節蛋白的表達，減少腫瘤抑制性生長因子的合成等多種途徑參與肺癌的發生發展［7-8］。本研究結果顯示，NSCLC組血清雌激素水平高于對照組，提示血清雌激素水平可能在NSCLC的發生發展中發揮作用，與其他研究結果一致［3，9］。HSU等［9］的研究發現，NSCLC患者血清雌激素水平較同性別正常對照人群顯著升高，而在NSCLC患者間無性別差異；CHE等［3］的研究也表明NSCLC患者經過抗雌激素治療后，可以顯著提高順鉑治療的依從性，表明血清雌激素水平升高與NSCLC的發生發展及轉歸存在關聯。

miRNA是一組具有21～25個堿基對的內源性非編碼單鏈RNA，且核苷酸序列高度保守，參與調節細胞的生長、增殖、分化和凋亡等活動［10］。多項研究表明，miRNA在腫瘤組織中表現出特異性的表達失調現象，這一現象為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路［11-12］。研究表明，miR-365參與抑制腫瘤增殖、侵襲和轉移等過程［13］。本研究結果顯示，NSCLC組miR-365表達水平低于對照組，不同組織學類型、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況患者miR-365表達水平間有差異，預示著miR-365可能參與了疾病的發展過程或者是疾病發展的觀測指標。研究證實，在胃癌中miR-365 主要通過作用于靶分子cyclin D1和CDK4 /6而調控細胞周期，從而抑制腫瘤細胞增殖［14］。KANG等［15］的研究也證實miR-365表達水平與甲狀腺轉錄因子NKX2-1呈負相關，而NKX2-1是調控細胞增殖的重要靶點，同時，轉染miR-365 模擬劑后發現能夠有效地抑制腫瘤細胞的增殖，而miR-365抑制劑卻能使腫瘤細胞少量增殖。

表1 不同特征NSCLC患者miR-365表達水平比較Table 1 Comparison of expression level of miR-365 in NSCLC patients with different characteristics

表1 不同特征NSCLC患者miR-365表達水平比較Table 1 Comparison of expression level of miR-365 in NSCLC patients with different characteristics

注：與腺癌比較，aP＜0.05；與高分化比較，bP＜0.05；c為F值

項目 例數 miR-365表達水平 t（F）值 P值性別男35 0.52±0.38 1.18 0.28女22 0.62±0.41年齡（歲）＜60 18 0.67±0.42 1.07 0.36≥60 39 0.43±0.26吸煙情況有33 0.61±0.39 1.16 0.31無24 0.49±0.41組織學類型腺癌 31 0.27±0.19 3.51c ＜0.01鱗狀細胞癌 22 0.77±0.51a腺鱗癌 4 0.91±0.35a分化程度高分化 6 0.87±0.28 2.07c 0.04中分化 33 0.59±0.43低分化 18 0.37±0.31b TNM分期Ⅰ～Ⅱ期 33 0.87±0.23 2.63 0.01Ⅲ～Ⅳ期 24 0.31±0.19淋巴結轉移無轉移 26 0.77±0.35 2.27 0.03有轉移 31 0.36±0.28

雖然miR-365表達水平在乳腺癌中的變化已有文獻報道［5］，但在肺癌中的表達情況及其與血清雌激素水平的關聯尚未見相關報道。本研究結果發現，NSCLC組血清雌激素水平與miR-365表達水平呈負相關，這表明NSCLC的發生發展可能與血清雌激素水平及其調控因子有關，但血清雌激素水平的變化與miRNA表達異常的因果關系如何，值得進一步研究。

本研究雖然觀察到血清雌激素水平和miR-365表達水平與NSCLC的腫瘤生物學特征存在一定關系，但是也存在樣本量偏小、觀察追蹤時間短等不足。后續研究中，在擴大樣本量的同時，增加對患者的觀察時間，進一步明確兩者的關聯，將為NSCLC的早期診斷或療效觀察提供新的選擇。

綜上所述，NSCLC患者血清雌激素水平高于正常人群，miR-365表達水平低于正常人群，且兩者具有相關性，可為NSCLC患者的早期診斷和治療提供新的思路。

作者貢獻：李鵬進行試驗設計與實施、撰寫論文并對文章負責；余捍東、趙晶進行資料收集整理、試驗實施與評估、資料收集；李樹坡進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

［1］GUO P，HUANG Z L，YU P，et al．Trends in cancer mortality in China：an update［J］．Ann Oncol，2012，23（10）：2755-2762．DOI：10.1093/annonc/mds069.

［2］王威，馬清峰.老年肺癌患者性激素水平的變化及意義［J］．中國老年學雜志，2016，36（5）：1223-1224．DOI：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.094.WANG W，MA Q F.Significance of sex hormone alteration in elder lung cancer patient［J］．Chinese Journal of Gerontology，2016，36（5）：1223-1224．DOI：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.094.

［3］CHE Y，SUN X，HUANG C，et al．Influence of tamoxifen or the combination of tamoxifen and cisplatin on the growth of human lung adenocarcinoma A549 cells［J］．Oncology and Translational Medicine，2014，13（11）：523-527．DOI：10.1007/s10330-014-0034-z/mds069.

［4］王鶴，劉志利，德偉，等．microRNA-335對人非小細胞肺癌細胞遷移、侵襲及增殖能力的影響［J］．南京醫科大學學報：自然科學版，2012，32（6）：795-799.

［5］YAN L X，HUANG X F，SHAO Q，et al．MicroRNA miR-21 overexpression in human breast cancer is associated with advanced clinical stage，lymph node metastasis and patient poor prognosis［J］．RNA，2008，14（11）：2348-2360．DOI：10.1261/rna.1034808.

［6］CHANSKY K，SCULIER J P，CROWLEY J J，et al．國際肺癌研究會分期項目 采用外科治療的非小細胞肺癌的預后因素和病理TNM分期［J］．楊永波，李志剛，譯.中國肺癌雜志，2010，13（1）：9-18.DOI：10.3779/j.issn.1009-3419.2010.01.02.CHANSKY K，SCULIER J P，CROWLEY J J，et al．The international association for the study of lung cancer staging project prognostic factors and pathologic TNM stage in surgically managed non-small cell lung cancer［J］．YANG Y B，LI Z G，translation.Chinese Journal of Lung Cancer，2010，13（1）：9-18．DOI：10.3779/j.issn.1009-3419.2010.01.02.

［7］陳名聲，徐焰，郝曉柯，等．血清性激素的水平對男性肺癌患者診斷的意義［J］．中國肺癌雜志，2005，8（4）：300-303.CHEN M S，XU Y，HAO X K，et al．The significance of serum sexual hormones' level in male patients with lung cancer［J］．Chinese Journal of Lung Cancer，2005，8（4）：300-303.

［8］徐袁秋，許會軍.非小細胞肺癌患者血清性激素的變化［J］．河 北 醫 藥，2011，33（20）：3050-3052．DOI：10.3969/j.issn.1002-7386.2011.20.004.XU Y Q，XU H J.The changes of serum sex hormones in patients with non-small-cell lung carcinoma［J］．Hebei Medical Journal，2011，33（20）：3050-3052．DOI：10.3969/j.issn.1002-7386.2011.20.004.

［9］HSU L H，LIU K J，TSAI M F，et al．Estrogen adversely affects the prognosis of patients with lung adenocarcinoma［J］．Cancer Sci，2015，106（1）：51-59．DOI：10.1111/cas.12558.

［10］WILLIAMS A E.Functional aspects of animal microRNAs［J］．Cell Mol Life Sci，2008，65（4）：545-562．DOI：10.1007/s00018-007-7355-9.

［11］WANG J，WANG X，WU G，et al．MiR-365b-3p，downregulated in retinoblastoma，regulates cell cycle progression and apoptosis of human retinoblastoma cells by targeting PAX6［J］．FEBS Lett，2013，587（12）：1779-1786．DOI：10.1016/j.febslet.2013.04.029.

［12］SINGH R，SAINI N.Downregulation of BCL2 by miRNAs augments drug-induced apoptosis——a combined computational and experimental approach［J］．J Cell Sci，2012，125（Pt 6）：1568-1578．DOI：10.1242/jcs.095976.

［13］高琳，王建宇，丁振華.miR-365在腫瘤中的研究進展［J］．生 命 科 學 研 究，2015，19（1）：91-94．DOI：10.16605/j.cnki.1007-7847.2015.01.018.

［14］郭水龍，朱圣韜，程芮，等．miR-365通過靶向E2F2抑制胃癌細胞增生和腫瘤形成［J］．首都醫科大學學報，2016，37（1）：1-5．DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.001.GUO S L，ZHU S T，CHENG R，et al．miR-365 inhibited the proliferation and tumorigenicity of gastric cancer cells by targeting E2F2［J］．Journal of Capital Medical University，2016，37（1）：1-5．DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.001.

［15］KANG S M，LEE H J，CHO J Y.MicroRNA-365 regulates NKX2-1，a key mediator of lung cancer［J］．Cancer Lett，2013，335（2）：487-494．DOI：10.1016/j.canlet.2013.03.006.

（收稿日期：2017-12-11；修回日期：2018-02-21）

（本文編輯：劉新蒙）