超聲提取的麥冬多糖聚集行為實驗研究

王小梅，金 文，程 磊，車岳鴻，傳楊陽，常 柯，郝大鵬

(西安航空學院 a.理學院；b.材料工程學院，西安 710077)

0 引言

麥冬，為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物，又名麥門冬、闊葉麥冬、沿階草等，其根如連珠節粒，肉質呈紡錘狀，入藥。麥冬性微寒，味甘微苦，具有養陰生津、潤肺止咳、降血糖等功效[1-2]。麥冬多糖是麥冬的主要成分之一，同樣具有多種生物活性，如免疫活性、降血糖、抗心肌缺血、耐缺氧能力、抗過敏活性等[3-4]。湯軍等[5]研究表明，麥冬多糖能顯著增加小鼠的胸腺重量和脾臟重量，激活小鼠網狀內皮系統的吞噬功能，并提高血清溶血素抗體水平，進而增強免疫活性。黃琦等[6]對47例2型糖尿病人在利用麥冬多糖治療前后分別檢測空腹血糖、餐前兩小時血糖、空腹血漿胰島素，結果表明，麥冬多糖具有降血糖及穩定血糖的作用，能使周圍組織對胰島素抵抗降低。目前，對麥冬多糖的微觀形貌及分子鏈構象研究較少，而微觀形貌和鏈構象與多糖的生物活性關系密切，因此，對麥冬多糖微觀形貌及鏈構象的研究意義重大。

原子力顯微鏡(AFM)為人們直接觀察生物大分子的微觀形貌提供了強有力的方法和手段。利用AFM可以在空氣中或者在溶液環境中直接對多糖分子進行觀察，制樣也比較簡單，檢測時能盡可能保持多糖分子的生理狀態和完整性[7-8]。而且，AFM測定多糖所需時間較短，可以獲得多糖樣品中大量單分子的統計學信息，目前已經被廣泛地應用到蛋白質、多糖等生物大分子的表面形貌和鏈構象的分析和研究中[9-11]。本文主要利用AFM對超聲提取的麥冬多糖的表面形貌、鏈構象進行觀測，獲得不同溶液環境中多糖分子鏈構象，聚集態行為特征等信息，為進一步研究多糖構效關系提供實驗依據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

麥冬，浙江產，購于西安市萬壽路中藥市場，Sephadex G-150凝膠，DEAE-cellulose52纖維素，氯化鈉、氫氧化鈉等均為分析純試劑，實驗用水為雙蒸水。

1.2 主要儀器

FD-1A真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器公司)、SPM29500J3型原子力顯微鏡(日本島津公司)、系列層析柱2.5×60 cm(上海琪特分析儀器有限公司)、TU1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、TB-215D電子天平(精度：1/105 g，北京賽多利斯儀器系統有限公司)、磁力攪拌器、RE252AA型旋轉蒸發器。

2 實驗內容與方法

2.1 麥冬多糖的提取

麥冬塊根，60 ℃下烘干，粉碎。將200g干燥的麥冬粉末置于1000mL燒杯中，加入4倍體積的95%乙醇，于超聲波清洗器中超聲脫脂，同時攪拌20min，離心，收集殘渣，此脫脂過程重復三次，干燥殘渣。利用超聲波輔助提取麥冬多糖。超聲提取條件：超聲 10s，間隔15s，超聲次數90次，超聲功率為80W，按此提取過程提取兩次，將兩次的提取液合并，經減壓濃縮，用四倍量95%乙醇純沉，離心，流水透析3天，真空冷凍干燥，得超聲提取的麥冬粗多糖，備用。

2.2 麥冬多糖的分離純化

DEAE-cellulose52色譜柱層析：纖維素陰離子交換劑DEAE-cellulose52經0.5mol/LNaOH 浸泡1h，蒸餾水洗到中性，再用0.5mol/L HCL浸泡1h，蒸餾水洗到中性，再用0.5mol/L NaOH浸泡1h，洗到中性，抽氣泡，裝柱，用蒸餾水平衡24h。將超聲提取的麥冬粗多糖0.5g溶于10mL蒸餾水中，抽濾，濾液注入DEAE-cellulose52色譜柱中，洗脫液為蒸餾水，流速：6s/滴，20min/管，洗脫液用全自動部分收集器收集，利用苯酚-硫酸法在487 nm波長下檢測糖含量。繪制DEAE-cellulose52色譜柱洗脫曲線圖(以試管數目為橫坐標，吸光度值為縱坐標)。合并各主峰溶液并濃縮，蒸餾水透析，冷凍干燥。

Sephadex G-150凝膠色譜柱層析：用適量蒸餾水浸泡Sephadex G-150葡聚糖凝膠，并用沸水煮2h，抽氣泡并裝柱，用蒸餾水平衡24h。將之前DEAE-cellulose52色譜柱層析收集的組分通過Sephadex G-150葡聚糖凝膠色譜柱分離。流速：4 s/滴，10 min/管。苯酚-硫酸法檢測。繪制Sephadex G-150凝膠色譜柱洗脫曲線圖(以試管數目為橫坐標，吸光度值為縱坐標)。合并各主峰溶液并濃縮，蒸餾水透析，冷凍干燥。

2.3 麥冬多糖原子力顯微鏡(AFM)觀察

樣品的制備：將純化后的麥冬多糖用蒸餾水溶解，配制成1mg/mL的麥冬多糖溶液，在磁力攪拌器下攪拌4 h。將攪拌均勻的麥冬多糖樣品用蒸餾水稀釋到100ug/mL。再分別配制0.005mol/L的NaOH溶液及0.005mol/L的NaCL溶液，備用。吸取0.25mL 100ug/mL的麥冬多糖溶液，用蒸餾水、0.005mol/L NaOH溶液及0.005mol/L NaCl溶液分別定容到5mL的容量瓶中，得到不同溶液環境中(蒸餾水、0.005mol/L及0.005mol/L NaCl)5ug/mL的麥冬多糖溶液，搖勻，備用。分別取5uL不同溶液環境中5ug/mL麥冬多糖，滴到新剝離的云母片上，在室溫、大氣下自然風干。

AFM觀測：將風干的待測樣品分別置于原子力顯微鏡下測試，圖像均在Contact模式下獲得，探針為Si3N4，探針的微懸臂長為200 μm，彈性系數為0.28 N/m，利用原子力顯微鏡附帶的軟件對AFM圖像的形態學特征(如寬度、高度等)進行分析。

3 實驗結果與討論

3.1 紫外吸收及蛋白質檢測

將超聲提取的麥冬多糖利用紫外可見分光光度計在190～400nm波長范圍內進行光譜掃描(見圖1)，檢測到多糖在260～280nm無吸收峰，說明該多糖樣品中不含有蛋白質及核酸。

圖1 麥冬多糖的紫外光譜掃描曲線

3.2 分離純化結果與分析

超聲提取的麥冬多糖經DEAE Cellulose-52色譜柱層析分離，用蒸餾水洗脫只得到一個峰(見圖2)，將此峰收集，濃縮，注入Sephadex G-150凝膠色譜柱中層析分離，得到一個單一對稱峰(見圖3)，說明經DEAE Cellulose-52色譜柱層析及Sephadex G-150凝膠色譜層析后得到的麥冬多糖純度較高。

圖2 麥冬多糖的DEAE-cellulose52層析柱色譜圖

圖3 麥冬多糖的Sephadex G-150凝膠層析柱色譜圖

3.3 原子力顯微鏡觀察結果與分析

3.3.1 麥冬多糖在水溶液中的原子力顯微鏡分析

圖4為5ug/mL麥冬多糖在水溶液中的AFM圖，從圖4中可以看出，麥冬多糖由聚合物長鏈折疊、纏繞形成，分枝較多。鏈的高度為1nm左右，鏈寬約為0.8μm左右，而多糖的分子單鏈直徑的理論值一般為0.1～1.0nm，我們得到的圖像寬度遠大于多糖單鏈分子的估計值，這一方面可能是由于針尖在掃描時與分子間相互作用致使多糖鏈產生增寬效應；另一方面，糖鏈與帶負電的云母表面間范德瓦爾斯相互作用，使多糖分子鏈聚集平鋪在云母表面。糖鏈通過糖單元間不同的連接方式衍生出許多大小不同的環狀結構，尺寸在幾百納米到幾個微米不等，說明麥冬多糖具有高度分枝的化學結構。麥冬多糖水溶液AFM圖像的結果與van der Waals 相互作用及鏈間氫鍵締合有關[12]。

圖4 5ug/mL麥冬多糖的AFM圖(溶劑：蒸餾水)

3.3.2 麥冬多糖在NaOH溶液中的原子力顯微鏡分析

圖5 5ug/mL麥冬多糖AFM圖(溶劑：0.005mol/L NaOH溶液)

圖5為麥冬多糖在0.005mol/L NaOH溶液中的AFM圖像，可以觀察到麥冬多糖在弱堿環境下形成如麥穗狀的多糖剛性鏈，其多糖分子鏈的平均高度在10nm左右，而多糖分子鏈的寬度約為120nm。與圖4麥冬多糖在水溶液中的AFM結果不同，這可能是由于弱堿環境下，麥冬多糖分子中的負離子發生了解離，與帶負電的云母片產生了更大的互斥效應，使得麥冬多糖分子形成剛性的分子聚合鏈，使得弱堿環境下麥冬多糖形成剛性分子股。

3.3.3 麥冬多糖在NaCl溶液中的原子力顯微鏡分析

圖6為5ug/mL麥冬多糖在0.005mol/L NaCl溶液中的AFM圖像，可以觀察到麥冬多糖呈現出樹枝狀結構及環狀結構。麥冬多糖分子鏈的平均高度在10～30nm，鏈寬度為0.1～0.8um不等，這是由于在微量的Na+存在的情況下，水溶液中的無序柔性分子轉變成為了鹽溶液中的剛性分子。與水溶液中麥冬多糖分子鏈的高度進行比較，結果表明，鹽溶液中麥冬多糖單分子鏈的高度有所增加，其主要原因是由于有鹽微粒附著在多糖鏈上，而且由于Cl-的存在，多糖分子與云母片之間的靜電吸附作用減弱，使得更多的麥冬多糖分子鏈相互纏繞在一起形成更粗的分子股，因此產生了數枝狀剛性多糖分子鏈結構。低視場下，可以更為清晰地觀察到麥冬多糖在鹽溶液中所呈的結構，其剛性分子的構象更加明顯。

4 結語

綜上所述，麥冬多糖分子的表面形貌及鏈構象會因為溶劑環境的不同而變化，分析麥冬多糖在不同溶劑中的AFM圖像可知，麥冬多糖在水溶液中由于靜電效應，多糖分子呈現柔性鏈分布在云母表面；在堿溶液中，麥冬多糖的AFM圖像與水溶液中不同，由于靜電排斥作用比在水溶液中強，使得多糖分子鏈不能呈現水溶液中的鏈環狀而是麥穗狀的剛性多糖分子。5ug/mL麥冬多糖在0.005mol/L NaCl溶液中時，由于靜電屏蔽效應，多糖分子呈樹枝狀或環狀結構，分子鏈的高度也因鹽的附著而有所增高，且多糖分子與云母片之間的靜電吸附作用減弱，多糖分子相互纏繞高度增加。以上結果均表明，通過改變多糖的溶液環境，可以改變其溶液構象，而多糖的溶液構象與其生物活性關系密切，這為多糖溶液構象及構效關系的研究提供了科學的實驗依據和理論支持。

[1] 王智杰,茍小林.麥冬降血糖作用的藥效學研究[J].中華中醫藥學刊,2003,21(6):898-899.

[2] KOU J,SUN Y,LIN Y,et al.Anti-inflammatory activities of aqueous extract from Radix Ophiopogon japonicus and its two constituents[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin,2005,28(7):1234-1238.

[3] XIONG S L,LI A,HUANG N,et al.Antioxidant and immunoregulatory activity of different polysaccharide fractions from tuber of Ophiopogon japonicas[J].Carbohydrate Polymers,2011,86(3):1273-1280.

[4] ZHANG J,FAN S,MAO Y,et al.Cardiovascular protective effect of polysaccharide from Ophiopogon japonicus in diabetic rats[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,82(1): 505-513.

[5] 湯軍,黃琦,徐智英,等.麥冬多糖的免疫活性研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,1998,4(9):44-46.

[6] 黃琦,許家鸞.麥冬多糖對2型糖尿病血糖及胰島素抵抗的影響[J].浙江中西醫結合雜志,2002,12(2):81-82.

[7] WANG H,WILKSCH J J,STRUGNELL R A,et al.Role of capsular polysaccharides in biofilm formation:an AFM nanomechanics study[J].ACS Applied Materials & Interfaces,2015,7(23):13007-13013.

[8] PI J,WANG Y,ZHU H,et al.Immunomodulatory effects of polysaccharide compounds in macrophages revealed by high resolution AFM[J].Scanning,2016,38(6):792-801.

[9] ZHANG T,ZHENG Y,COSGROVE D J.Spatial organization of cellulose microfibrils and matrix polysaccharides in primary plant cell walls as imaged by multichannel atomic force microscopy[J].Plant Journal for Cell & Molecular Biology,2016,85(2):179-192.

[10] KOZIOL A,CYBULSKA J,PIECZYWEK P M,et al.Evaluation of structure and assembly of xyloglucan from tamarind seed(Tamarindus indica L.)with atomic force microscopy[J].Food Biophysics,2015,10(4):396-402.

[11] GROSS L,MOHN F,MOLL N,et al.The chemical structure of a molecule resolved by atomic force microscopy[J].Science,2009,325(5944):1110-1114.

[12] HOH J H,CLEVELAND J P,PRATER C B,et al.Quantized adhesion detected with the atomic force microscope[J].Journal of the American Chemical Society,2002,114(12):4917-4918.