應(yīng)用小分子干擾RNA技術(shù)以慢病毒為載體抑制乳腺癌淋巴管生成因子VEGF-C的實驗研究

羅國慶 周晶晶 李關(guān)杰 梁計煥 劉秋華 李思文 胡寧東 夏旭

乳腺癌是全球威脅女性健康的主要疾病之一，我國乳腺癌的發(fā)病率正逐年上升，并且呈年輕化的趨勢[1]。淋巴道轉(zhuǎn)移是決定乳腺癌預(yù)后最重要的因素之一[2]。研究表明許多腫瘤存在淋巴管新生，血管內(nèi)皮生長因子C （vascular endothelial growth factor C，VEGF-C） 是重要的促淋巴管生成因子[3]。VEGF-C可通過激活其特異性受體VEGFR-3促進腫瘤內(nèi)淋巴管的生成，進而促進淋巴轉(zhuǎn)移；有研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C還有促進乳腺癌細(xì)胞遷移的功能，這些與腫瘤淋巴道播散轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[3、4]。因此，VEGF-C可以作為治療與預(yù)防乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶點，降低體內(nèi)VEGF-C的表達(dá)水平有可能抑制乳腺癌淋巴管新生與淋巴道轉(zhuǎn)移。RNAi技術(shù)的不斷成熟，為有效降低VEGF-C的表達(dá)提供了重要的理論依據(jù)與技術(shù)支持。

本研究使用針對人VEGF-C基因的RNAi片段，以慢病毒為載體，感染體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，用Real-time PCR和Western blot方法檢測體外干擾后VEGF-C的表達(dá)水平變化；利用小室侵襲實驗檢測慢病毒感染后乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的改變。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC，USA）。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 siRNA慢病毒 購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；VEGF-C-siRNA序列為5'-CCTCAACT CAAGGACAGAA-3'，陰性對照siRNA序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。VEGF-C-siRNA慢病毒以及陰性對照siRNA慢病毒的滴度分別為5×108TU/ml、2×109TU/ml，均攜帶綠色熒光標(biāo)記物。

1.1.3 主要試劑 含雙抗（青、鏈霉素）的細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清、胰蛋白酶購自北京Solarbio生物科技有限公司。VEGF-C、GAPDH抗體購自Santa公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和dNTP購自Promega公司；Oligo dT購自上海生工；……