老年宮頸癌組織中轉化生長因子-β1、叉頭框蛋白P3、程序性死亡蛋白1及其受體的表達及意義

高雁榮 郭 玉

(安陽市腫瘤醫院婦三科，河南 安陽 455000)

研究表明，腫瘤免疫逃逸可能在宮頸癌形成過程中發揮重要作用。轉化生長因子(TGF)-β1是細胞生長抑制因子，參與免疫調節反應，與多種腫瘤的發生發展密切相關〔1,2〕。叉頭樣轉錄因子(FOX)P3可通過調控Treg細胞發育、分化和成熟，發揮免疫抑制作用〔3,4〕。程序性死亡受體配體-1(PD-L1)及程序性死亡受體(PD)-1是免疫反應中極其重要的協同刺激分子，其激活有助于腫瘤免疫逃逸〔5,6〕。TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1在多種腫瘤中表達異常。本研究通過分析TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1在不同組織中的表達及相關性，并分析這四種蛋白表達水平與老年宮頸癌患者臨床病理特征的關系，旨在探討TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1在老年宮頸癌發生中的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取安陽市腫瘤醫院2014年9月至2016年9月手術切除的老年宮頸癌患者的癌組織60例及老年宮頸上皮內瘤樣變患者的宮頸上皮內瘤樣變組織30例，同時收集因子宮肌瘤行全子宮切除術且術后病理證實無宮頸病變的組織標本共20例。所有組織標本均置于液氮中保存，標本均經HE染色，經3名有經驗的病理醫師確診，納入對象均未接受過放、化療等。老年宮頸癌患者年齡60～78歲，平均(69.4±4.8)歲；臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期14例，Ⅲ期18例，Ⅳ期16例。腫瘤大小：<3 cm 28例，≥3 cm 32例。組織學分級：中高分化27例，低分化33例；有淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移34例，病理類型：38例為鱗狀細胞癌，17例為腺癌，5例為腺鱗癌。宮頸上皮內瘤樣變患者年齡60～76歲，平均(69.1±4.3)歲；正常宮頸組織患者年齡61～78歲，平均(68.8±4.7)歲。三組研究對象年齡經比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會審核同意。

1.2主要試劑 小鼠抗人TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1一抗均購自Santa Cruz公司(美國)，免疫組化二抗購自北京中山金橋生物技術有限公司。

1.3免疫組化染色 石蠟包埋組織切片經二甲苯脫蠟，在100%、95%、85%的酒精浸泡水化，在98℃的枸櫞酸鈉溶液(0.01 mol/L，pH6.0)中浸泡15 min進行抗原修復，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10～15 min以降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色。室溫封閉20 min，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫孵育1 h，DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，流水沖洗及時中止反應，封片，鏡檢。

1.4免疫組化結果判定 在放大400倍的顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取5個以上觀察視野。綜合染色強度和陽性細胞百分比判定，染色強度：0分為無著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；陽性染色百分比(<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分)。兩項評分乘積小于2分判定為陰性，≥2分判定為陽性。

1.5統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗，相關性分析采用列聯系數分析。

2 結 果

2.1老年宮頸癌組織TGF-β1蛋白的表達 與正常宮頸組織及宮頸上皮內瘤樣變組織比較，老年宮頸癌組織中TGF-β1蛋白陽性表達率明顯較高(P<0.05)；與正常宮頸組織比較，宮頸上皮內瘤樣變組織中TGF-β1蛋白陽性表較高(P<0.05)；正常宮頸組織中少見TGF-β1表達，見圖1，表1。

A：正常宮頸組織；B：宮頸上皮內瘤樣變組織；C：老年宮頸癌組織；下圖同圖1 不同宮頸組織中 TGF-β1蛋白表達(DAB，× 400)

2.2老年宮頸癌組織FOXP3蛋白的表達 與正常宮頸組織和宮頸上皮內瘤樣變組織比較，FOXP3蛋白在老年宮頸癌組織中表達的陽性率明顯較高；與正常宮頸組織比較，宮頸上皮內瘤樣變組織中FOXP3蛋白表達的陽性率明顯較高(P<0.05)，見表1，圖2。

2.3老年宮頸癌組織PD-1蛋白的表達 與正常宮頸組織和宮頸上皮內瘤樣變組織比較，PD-1蛋白在老年宮頸癌組織中表達的陽性率明顯較高；與正常宮頸組織比較，宮頸上皮內瘤樣變組織中PD-1蛋白表達的陽性率明顯較高(P<0.05)，見表1，圖3。

2.4老年宮頸癌患者組織PD-L1蛋白的表達 與宮頸上皮內瘤樣變組織比較，PD-L1蛋白在老年宮頸癌組織中表達的陽性率明顯較高(P<0.05)，而正常宮頸組織無PD-L1的表達，見表1，圖4。

圖2 不同宮頸組織中 FOXP3蛋白的表達(DAB，×400)

圖3 不同宮頸組織中 PD-1蛋白的表達(DAB，×400)

圖4 不同宮頸組織中 PD-L1蛋白的表達(DAB，×400)

表1 不同組織標本中各蛋白的表達比較〔n(%)〕

與正常宮頸組織比較：1)P<0.05；與宮頸上皮內瘤樣變組織比較：2)P<0.05

2.5老年宮頸癌組織TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1表達與臨床病理特征的關系 TGF-β1的陽性表達與老年宮頸癌的淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與腫瘤大小、臨床分期及組織學分級無關(P>0.05)。FOXP3的陽性表達與老年宮頸癌的組織學分級和淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與腫瘤大小、臨床分期無關(P>0.05)。PD-1的陽性表達與老年宮頸癌的組織學分級和淋巴結轉轉移有關(P<0.05)，而與腫瘤大小、臨床分期無關(P>0.05)。PD-L1的陽性表達與老年宮頸癌的淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與腫瘤大小、臨床分期及組織學分級無關(P>0.05)，見表2。

2.6老年宮頸癌組織TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1表達的相關性 相關性分析發現，TGF-β1與FOXP3表達呈正相關(r=0.685，P=0.003)；PD-1與PD-L1表達呈正相關(r=0.412，P=0.000)；TGF-β1與PD-1、PD-L1的表達無相關性(r=-0.177、0.137，P=0.171、0.284)，FOXP3與PD-1、PD-L1的表達無相關性(r=0.163、0.023，P=0.206、0.757)。

表2 老年宮頸癌患者TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1表達與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

3 討 論

目前宮頸癌發病機制尚不完全清楚，對其預防和治療仍是難點。因此，探討宮頸癌發生發展機制，將為該類患者的治療提供新的治療策略和理論依據，并為該病防治藥物的研發提供新機制、新靶點、新方向。免疫監視學說認為，免疫系統的一個關鍵作用是識別并清除腫瘤，免疫系統可監視腫瘤的發生并通過免疫機制殺滅腫瘤，若機體免疫功能低下則可能發生腫瘤。在腫瘤發生、發展過程中，細胞衍生出逃避免疫監視的方式，腫瘤能夠逃避免疫監視則被視為腫瘤的十大特征之一。研究發現，宮頸癌發生發展中宮頸局部微環境的免疫監視功能下降所導致的免疫逃逸現象起到了重要的作用，但導致宮頸癌免疫監視能力下降的機制目前尚不清楚。

TGF-β1是一類多肽類細胞因子，具有多種功能，可通過其信號通路發揮生物學效應，廣泛參與機體各種生理病理過程。惡性腫瘤細胞可分泌大量的TGF-β1，發揮免疫抑制因子作用。TGF-β1在不同惡性腫瘤患者中有不同程度的表達并參與腫瘤的發生、發展及預后〔7，8〕。FOXP3是一種多功能的轉錄因子，其發揮免疫抑制作用的途徑是通過調控Treg細胞的發育、分化和成熟。研究發現，FOXP3陽性表達的細胞在腫瘤免疫逃逸機制中發揮了相當重要的作用，并且FOXP3在多種腫瘤中表達上調，如肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等〔9，10〕。PD-1主要表達在活化T細胞上，是個抑制性受體，可與其配體PD-L1結合，抑制T細胞增殖、活化。PD-L1、PD-1在多種腫瘤中表達異常，可傳遞負性調節信號，使得腫瘤細胞能夠逃避機體免疫機制的監控、殺傷〔11～15〕。本研究提示TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1在老年宮頸癌發生中發揮重要作用，但其在腫瘤細胞中的高表達是如何形成的尚待進一步研究。本文結果提示TGF-β1、PD-L1、FOXP3、PD-1與老年宮頸癌患者的不良預后密切相關，分析可能原因為，此4種蛋白可能直接或間接地參與宮頸癌細胞的侵襲、遷移能力調控，并且FOXP3、PD-1可能還參與宮頸癌細胞分化能力的調控；本研究結果還提示TGF-β1與FOXP3、PD-1與PD-L1可能在同一通路中發揮作用。

綜上所述，老年宮頸癌組織中TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1蛋白表達顯著升高，可能與機體對腫瘤細胞的免疫監視能力下降密切相關，進而導致老年宮頸癌的發生發展，研究這些蛋白的表達對老年宮頸癌患者的治療、預后具有一定的臨床價值。

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