趨化因子17對人鼻咽癌干細胞轉移分化能力的影響

李建民 王麗萍 白偉良

(青海大學附屬醫院耳鼻喉科，青海 西寧 810001)

鼻咽癌是常見的呼吸系統惡性腫瘤疾病之一，是侵襲性較強的頭頸部惡性腫瘤，極易發生淋巴結轉移及肝肺等遠處轉移，影響患者全身多處器官，可嚴重影響患者的健康和生存質量，甚至引發死亡等不良預后的發生〔1～3〕。趨化因子(CCL)是可趨化細胞定向移動的小分子肽，其中的CCL17是與免疫微環境密切相關的因子，CCL可通過與CCL4結合而引發分子構象的改變，導致細胞外的鈣離子內流和細胞貯存的鈣離子釋放，引發細胞質內鈣離子濃度的明顯增加，引發靶細胞反應，從而參與白細胞的遷移并起到調節炎癥和調節免疫細胞分化的作用，促進血管重塑〔4～6〕。因此，趨化因子17亦可能是與鼻咽癌等腫瘤血管生成、侵襲轉移及分化等相關的因子。本研究探討CCL17對人鼻咽癌肝細胞轉移分化能力的影響。

1 材料和方法

1.1對象 2015年1月至2016年1月20例青海大學附屬醫院鼻咽癌手術切除所得的鼻咽癌組織，病例均經術后病理學檢查證實為鼻咽癌，術前未經放化療等相關抗腫瘤治療，實驗標本的利用均已獲得患者本人或其委托人的知情同意。進行鼻咽癌組織細胞的培養傳代及鼻咽癌干細胞的分選富集，獲得20例鼻咽癌干細胞。其中男12例，女8例，年齡26～75歲，平均(54.66±5.78)歲，26～59歲6例，60～75歲14例。

1.2試劑和儀器 恒溫箱(江蘇佳美儀器有限公司)、流式細胞儀(德國Partec公司)、離心管、玻璃瓶、吸管、試管等(廣東東普醫療科技有限公司)、改良杜氏伊格爾培養基(DMEM)/F12培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)、RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)、逆轉錄試劑盒(美國Promega公司)、實時定量(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒和SYBR Premix EX Taq(日本Takara公司)、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、脂質體轉染液 LipofectamineTM轉化生長因子β1(美國Invitrogen 公司)、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)、堿性成纖維細胞生長因子(美國Invitrogen 公司)、潑尼松、胰島素、β甘油磷酸鈉、維生素C、3-異丁基-1-甲級黃嘌呤、吲哚美辛(美國Sigma 公司)、醫用恒溫水浴箱(美國SHELLAB公司)。

1.3細胞復蘇 實驗器具紫外線照射1 h后將需復蘇的細胞迅速放入37℃水浴箱中，搖晃使固態細胞融化，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 ml細胞培養液，移入培養瓶中，補充細胞培養液至5 ml，輕晃使細胞均勻分布，將培養瓶置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養。

1.4細胞傳代培養 細胞融合度達到80%以上時采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次，去除殘留血清，加入0.25%的胰酶1 ml消化至細胞變小且細胞間隙變寬，棄去胰酶并加入15 ml的細胞培養液，混勻，均分于3個培養瓶中進行培養。將細胞再次進行消化離心，加入細胞凍存液1.5 ml移入冷凍管中，液氮保存。

1.5鼻咽癌干細胞得分選富集 癌細胞無血清懸浮培養至對數生長期,胰酶消化,制備成單細胞懸液，進行細胞計數，調整細胞密度，采用流式細胞儀分選p75NTR+細胞(鼻咽癌干細胞)。

1.6CCL17轉染 將鼻咽癌肝細胞放入培養皿中并觀察鼻咽癌干細胞，取生長狀態良好的鼻咽癌干細胞鋪于2個6孔板中，至細胞融合度達到80%左右時向其中一個6孔板各孔添加預先配置的脂質體Lipofectamine20005 μl和CCL17 3.75 μl無血清RPMI1640培養液各孔均添加2 ml，將化學合成的CCL17(序列為：5'-GGGACTGCTGCCTGGAGTAC-3')瞬時轉染鼻咽癌干細胞輕輕晃勻后置入孵箱中進行孵育。2 d后提取總RNA，檢測CCL17和血管內皮生長因子(VEGF)的mRNA表達相對強度和蛋白表達水平。

1.7抗CCL17抑制劑轉染 將鼻咽癌肝細胞放入培養皿中并觀察鼻咽癌干細胞，取生長狀態良好的鼻咽癌干細胞鋪于2個6孔板中，至細胞融合度達到80%左右時向其中一個6孔板各孔添加預先配置的脂質體Lipofectamine20005 μl和3.75 μl無血清RPMI1640培養液，采用化學合成的siRNAoligo，序列為：5'-ATGTTTTTGCTACCGTAGGGA-3'，2 d后提取總RNA，檢測CCL17和VEGF的mRNA表達相對強度和蛋白表達水平。

1.8向成骨誘導分化 將鼻咽癌干細胞培養于含10%胎牛血清的培養基中，添加0.1 μmol/L的潑尼松、50 μmol/L的維生素C及10 mmol/L的β甘油磷酸鈉，每3 d定期更換培養基，共培養21 d。分別于培養前和培養后提取總RNA，采用RT-PCR檢測骨鈣素等成骨標志物的mRNA表達水平。

1.9向軟骨誘導分化 將鼻咽癌干細胞培養于含10%胎牛血清的培養基中，添加10 μg/L的轉化生長因子、1 μg/L的堿性成纖維細胞生長因子及6.25 mg/L的胰島素，每3 d定期更換培養基，共培養21 d。分別于培養前和培養后提取總RNA，采用RT-PCR檢測Ⅱ型膠原等軟骨標志物的mRNA表達水平。

1.10向脂肪誘導分化 將鼻咽癌干細胞培養于含10%胎牛血清的培養基中，培養至90%融合，添加1 μmol/L的潑尼松、0.5 mmol/L的3-異丁基-1-甲級黃嘌呤、2 μmol/L的胰島素及200 mmol/L的吲哚美辛，每3 d定期更換培養基，共培養21 d。分別于培養前和培養后提取總RNA，采用RT-PCR檢測脂聯素等脂肪標志物的mRNA表達水平。

1.11Transwell小室法 常規水化基底膜，分別于轉染前后2 d收集細胞，并調整細胞數為5×105/ml，向Transwell小室添加含10%胎牛血清的RPMI1640培養液900 μl和200 μl的細胞懸液，將細胞接種于Transwell小室，培養12 h后采用4%多聚甲醛進行為時0.5 h的固定，棄去固定液，采用0.1%結晶紫染色20 min，棄去染色液并采用PBS沖洗3次。倒置Transwell小室于顯微鏡下放大100倍，觀察并進行細胞計數。

1.12劃痕實驗 劃痕實驗操作同參考文獻〔7〕。

1.13RT-PCR檢測轉染前后及誘導分化前后各因子mRNA 相對表達量的檢測 常規提取總RNA，采用TaqMan@ Small RNA Assays試劑盒進行逆轉錄反應，操作按照試劑盒說明進行，將cDNA冷藏于-20℃恒溫箱中備用。實行RT-PCR檢測，操作亦按照TaqMan@ Small RNA Assays試劑盒說明書進行，反應條件分別為先于50℃環境中反應2 min，再于95℃環境中反應10 min，再于95℃環境中反應15 s，最后于60℃環境中反應60 s，共進行40個循環。進行3次獨立重復檢測。采用7500SDS v1.3.1軟件操作，以18 S rRNA為內參，所得數據采用2-ΔΔCt公式進行分析，其中Ct為各復孔平均值，ΔCt=Ct目標-CtU6，ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt未處理組。

1.14統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1CCL17轉染前后CCL17和VEGF mRNA相對表達量的比較 人工合成的CCL17瞬時轉染后，鼻咽癌干細胞中CCL17和VEGF mRNA表達相對強度較轉染前明顯升高(P<0.001)，見表1。

表1 CCL17轉染前后CCL17和VEGF mRNA相對表達量的比較

2.2CCL17轉染前后鼻咽癌干細胞侵襲及遷移能力比較 人工合成的CCL17瞬時轉染后，鼻咽癌干細胞侵襲及遷移能力〔Transwell穿膜細胞數(146.65±21.75)〕較轉染前(65.58±6.68)明顯升高(t=15.880，P=0.000)。

2.3CCL17轉染對分化誘導的骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯素mRNA表達相對強度的影響 人工合成的CCL17瞬時轉染后，鼻咽癌干細胞骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯素mRNA表達相對強度轉移降低(P<0.001)，見表2。

表2 CCL17轉染對分化誘導的骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯素mRNA表達相對強度的影響

2.4人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時轉染前后CCL17和VEGF mRNA相對表達量的比較 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時轉染后，鼻咽癌干細胞中CCL17和VEGF mRNA表達相對強度較轉染前明顯降低(P<0.001)，見表3。

2.5人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時轉染前后鼻咽癌干細胞侵襲及遷移能力 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時轉染后，鼻咽癌干細胞侵襲及遷移能力〔Transwell穿膜細胞數(11.16±4.54)〕較轉染前(65.86±6.68)明顯降低(t=30.288，P=0.000)。

2.6人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時轉染對分化誘導的骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯素mRNA表達相對強度的影響 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時轉染后，鼻咽癌干細胞骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯素mRNA表達相對強度較轉染前明顯升高(P<0.001)，見表4。

表3 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時轉染前后CCL17和VEGF mRNA相對表達量的比較

表4 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時轉染對分化誘導的骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯素mRNA表達相對強度的影響

3 討 論

鼻咽癌是最為常見的頭頸部惡性腫瘤，其發病率近年來隨著環境污染的加劇而呈現快速增長的趨勢〔8〕。鼻咽癌惡性程度高，病情嚴重，極易發生淋巴結轉移及肝肺等的遠處轉移，累及全身多處臟器，引發全身多處器官的病變，加重患者病情，最終造成死亡等不良預后情況的發生〔9～11〕。因此，對鼻咽癌進行有效的防治十分重要。鼻咽癌治療的效果差，其治療后復發率高，且常伴有遠處轉移，其治療困難，療效欠佳〔12,13〕。鼻咽癌的侵襲轉移是影響其預后的重要因素之一〔14〕。抑制鼻咽癌侵襲轉移可能有助于鼻咽癌治療效果的提高和預后情況的改善。腫瘤的生長和侵襲轉移均依賴其血管的生成，而VEGF是與腫瘤血管生成密切相關的因子，在腫瘤血管生成中具有重要作用，可促進腫瘤血管的形成而促進腫瘤生長和轉移〔15～17〕。本研究結果亦發現，鼻咽癌干細胞中的VEGF表達水平高，可通過發揮其促進血管生成的作用而促進鼻咽癌的轉移和發展。因此對VEGF表達進行抑制從而抑制腫瘤血管形成、腫瘤生長及腫瘤轉移對抑制鼻咽癌等惡性腫瘤的轉移和改善其療效具有重要意義。腫瘤的分化程度與腫瘤的惡性程度密切相關〔18〕。高分化腫瘤的惡性程度低，常無轉移，僅有部分可出現腫瘤的復發，而低分化腫瘤的惡性程度高，極易發生轉移和復發〔19～21〕。本研究結果發現，鼻咽癌的分化程度較低，其惡性程度高，急需有效的干預。因此通過采取措施促進鼻咽癌分化亦可能是治療鼻咽癌的有效方法。本研究結果表明，CCL17在鼻咽癌的發生發展中具有重要作用。因此，CCL17可能成為鼻咽癌治療的靶基因之一。本研究結果提示CCL17可能通過調控VEGF促進鼻咽癌血管生成而提高鼻咽癌的侵襲轉移能力，并抑制鼻咽癌的分化，是鼻咽癌的促癌因子。CCL17可能作為鼻咽癌治療的靶基因，通過抑制CCL17的表達可能有助于抑制其腫瘤的生長和侵襲轉移，促進其腫瘤分化，降低其腫瘤惡性程度，抑制鼻咽癌轉移和復發的發生，達到良好的治療效果，從而改善鼻咽癌預后情況。

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