IL-12家族基因多態性對細胞因子合成及老年重癥全身感染預后的影響

李媛莉 趙繼波 李福龍 黃樹偉 李樹鐵 汪業銘 滕金亮

(河北北方學院附屬第一醫院重癥醫學科，河北 張家口 075000)

全身感染發展過程中起關鍵作用的細胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-12等均存在基因多態性〔1〕。研究發現，全身感染患者中TNFB2發生頻率增加，攜帶該等位基因的患者死亡率明顯增加〔2〕。亦有研究表明，IL-12家族中部分等位基因與全身感染發病程度和預后存在明顯關聯〔3〕；但有關細胞因子基因多態性對全身感染預后的影響機制仍未明確。本次研究通過分析IL-12家族細胞因子基因中IL-12A內含子6區含46 bp的同向重復結構可變數多態性、IL-12B啟動子區511位點多態性及IL-12RN內含子2區含86 bp的同向重復結構可變數多態性中不同等位基因對外周血單核細胞IL-12α、IL-12β、IL-12ra mRNA表達及血漿細胞因子合成的影響，探討其與老年重癥全身感染預后的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2016年1月至2017年3月河北北方學院附屬第一醫院收治的老年重癥全身感染患者48例為研究組，其中男31例，女17例，年齡62～81歲，平均(69.45±7.60)歲。選取同期在醫院體檢的健康老年志愿者50人為對照組，其中男29人，女21人，年齡60～73歲，平均(66.13±4.28)歲。本研究經醫院倫理委員會同意，受試者均簽署知情同意書。

1.2IL-12家族基因多態性分析 使用鹽析法從兩組受試者外周血白細胞中提取基因組DNA，PCR擴增目的片段，引物序列分別為：①IL-12A(內含子6，VNTR)上游：5'-CGGAGATCTG AGTATCTTGAATCAG-3'；下游：5'-CACTCCAGTCCGGTAACGTGAC-3'。②IL-12B(內含子6，VNTR)上游：5'-CGGAGATCTGAGTATCTTGAATCAG-3'；下游：5'-CACTCCAGTCCGGTAACGTGAC-3'。③IL-12RN(內含子2，VNTR)上游：5'-GAGTCGTTGTGAGGATA-3'；下游：5'-AGGACCAGA-CGTCCATT-3'。反應條件為：98℃ 2 min、96℃ 1 min、40℃ 1 min，72℃ 2 min，共40個循環，74℃延伸5 min。擴增產物經限制性內切酶消化后行瓊脂糖凝膠電泳分離目標條帶。

1.3外周血單核細胞分離與培養 取對照組外周血20 ml，抗凝處理后2 000 r/min離心，收集血漿。Ficoll一步法分離單核細胞和白細胞，取白細胞層行IL-12家族基因多態性分析；取單核細胞層分離并培養外周血單核細胞，使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，顯微鏡下調整細胞濃度至1×106/L，均勻接種到6孔板中，2 ml/孔，37℃ 5%CO2的培養箱中孵育24 h，取出培養板，向其中3孔加入終濃度為1 μg/ml的脂多糖，另外3孔加入等體積的生理鹽水為空白對照，繼續培養6 h，收集細胞和培養液上清，-20℃保存待測。

1.4細胞因子mRNA半定量分析 使用SV總RNA純化系統提取外周血單核細胞總RNA；RT-PCR檢測細胞因子表達，引物序列為IL-12α上游：5'-CAGAGACTTAGTCTTTAGGAAGATAG-3'；下游：5'-GTACAGTTTAAAGTGACGAAGTAGG-3'。IL-12β上游：5'-CAGAGACTTAGTCTTTAGGAAGATAG-3'；下游：5'-GTACAGTTTAAAGTGACGAAGTAGG-3'。IL-12ra上游：5'-CCGGAGGCGTCAGTGGATTAGTGAGA-3'；下游：5'-ATGATGAGCAGGAGGACCTTCATCTT-3'。反應條件為：95℃ 5 min、95℃ 1 min、40℃ 1 min，72℃ 2 min，共35個循環，74℃延伸5 min。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為內參計算目標條帶的相對表達量。

1.5細胞因子濃度檢測和預后觀察 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測研究組和對照組受試者血漿中IL-12α、IL-12β、IL-12ra濃度，檢測試劑盒購于上海康朗生物科技有限公司，操作嚴格按試劑盒說明進行。對研究組進行為期3個月的隨訪，記錄住院及隨訪期間存活或死亡情況。

1.6統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗和χ2檢驗。

2 結 果

2.1IL-12家族基因多態性分布情況 因IL-12A、IL-12B、IL-12RN等位基因3和4的發生頻率極低，因此本研究未對其進行探索。研究組患者攜帶等位基因IL-12A1、IL-12A2、IL-12B1、IL-12B2、IL-12RN1頻率與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)；研究組患者攜帶IL-12RN2頻率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2脂多糖刺激外周血單核細胞后細胞因子等位基因表達情況 對照組外周血單核細胞經脂多糖刺激后，細胞因子IL-12α、IL-12β、IL-12ra mRNA相對表達量均明顯高于生理鹽水處理組，差異有統計學意義(P<0.05)；脂多糖刺激組IL-12A和IL-12B各等位基因mRNA相對表達量之間差異無統計學意義(P>0.05)；等位基因IL-12RN2相對表達量明顯高于IL-12RN1，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3IL-12家族基因多態性對老年重癥全身感染預后的影響 研究組患者中IL-12α、IL-12β、IL-12ra細胞因子各自2號等位基因攜帶者的死亡率均明顯高于1號等位基因，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

2.4等位基因對兩組受試者血漿細胞因子濃度的影響 研究組各等位基因攜帶者血漿IL-12α、IL-12β、IL-12ra濃度均明顯高于對照組，差異有統計學意義(均P<0.01)；IL-12A1與IL-12A2，IL-12B1與IL-12B2等位基因攜帶者對應的細胞因子血漿濃度之間差異均無統計學意義(均P>0.05)；等位基因IL-12RN2攜帶者血漿IL-12ra濃度明顯高于IL-12RN1攜帶者，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表1 兩組受試者IL-12家族基因多態性分布情況〔n(%)〕

與對照組相比：1)P<0.05

表2 對照組外周血單核細胞中細胞因子各等位基因相對表達量比較

與等位基因1相比：1)P<0.05；與生理鹽水組比較：2)P<0.05；表3同

表3 IL-12家族各細胞因子等位基因攜帶者預后情況比較〔n(%)〕

表4 等位基因對兩組受試者血漿細胞因子濃度的影響

與對照組相比：1)P<0.05；與IL-12RN1相比：2)P<0.05

3 討 論

不同機體對感染的反應性存在明顯差異，當感染程度相似時，部分患者全身炎性反應較重，治療預后理想；而部分患者炎性反應炎癥，病情發展迅速，常出現MODS或休克〔4〕。相關研究顯示，TNF B等位基因2攜帶者全身感染的發生風險明顯增加，炎癥感染者中TNFB2純合子死亡率明顯高于其他基因型者〔5〕。后續研究發現，TNF其他相關基因多態性和IL-12ra基因多態性與全身感染治療預后明顯相關〔6〕。提示細胞因子基因多態性是影響機體對感染反應程度的主要因素之一。IL-12家族細胞因子IL-12α、IL-12β、IL-12ra在全身炎癥反應和平衡方面具有重要調控作用；其細胞因子相關基因內含子和啟動子存在基因多態性〔7〕。動物實驗顯示，部分等位基因對基因轉錄和蛋白質合成具有調控作用〔8〕。IL-12家族細胞因子基因多態性在調控老年人對炎性刺激的反應性方面仍待闡明。本次研究顯示，老年重癥全身感染患者中等位基因IL-12RN2的攜帶率明顯增加且死亡率明顯升高。體外細胞學研究發現，等位基因IL-12RN2攜帶者外周血單核細胞受脂多糖刺激后，細胞因子IL-12ra合成量明顯高于IL-12RN1攜帶者。IL-12ra是體內重要抗炎細胞因子，可對抗促炎細胞因子IL-1α、IL-1β的生物活性并調節體內促炎/抗炎平衡。當IL-12ra分泌過多時會過度增強體內抗炎反應，出現代償性抗炎反應綜合征，引發機體免疫麻痹狀態。本次研究中攜帶IL-12RN2等位基因的老年全身感染患者死亡率明顯增加與IL-12ra分泌增加有關；老年全身感染患者中IL-12A2、IL-12B2攜帶者死亡率明顯增加，但對應細胞因子的血漿濃度之間無明顯差異，可能原因為，上述基因改變對自身編碼基因表達水平無明顯影響，但對相關的其他基因功能產生影響，進而影響老年全身性感染患者的預后。綜上所述，遺傳因素是導致老年全身性感染患者炎性反應程度不同的主要原因。在IL-12RN基因多態性中，等位基因IL-12RN2攜帶者出現全身感染時，體內出現過度免疫抑制的風險較高，引發不良預后。

4 參考文獻

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