不同劑量雷公藤多苷對小鼠結腸炎模型的作用及機制

張瑜鴻 苗新普

(海南省疾病預防控制中心門診內科，海南 海口 570203)

潰瘍性結腸炎(UC)是結腸黏膜及黏膜下層常見的慢性非特異性炎癥反應性疾病，臨床患者以腹痛、腹瀉、黏液膿血便等為主要表現，具有病程長、易反復、并發癥多、預后差等特征。歐美國家UC患病率較高，約為205/10萬～240/10萬，我國雖為UC的低發國家，但近年來UC的患病率亦呈不斷上升趨勢〔1，2〕。關于UC的病因及發病機制目前尚未明確闡明，多數學者認為與腸黏膜的免疫反應失衡密切相關〔3〕，近年來Toll樣受體(TLR)/核因子(NF)-κB信號通路在各類變應性疾病發生機制中的作用受到廣泛關注〔4〕。雷公藤多苷是一類從衛矛科植物雷公藤中提取精制的脂溶性混合物，具有顯著的免疫抑制、抗炎、抗腫瘤等功效〔5〕。有研究〔6〕指出，雷公藤多苷對UC小鼠具有顯著改善作用，其作用機制可能與TLR/NF-κB信號通路的激活，從而發揮免疫抑制作用有關。本研究通過建立小鼠UC模型，研究不同劑量雷公藤多苷對UC小鼠的作用效果，旨在探討雷公藤多苷對UC的作用機制，為制定UC的臨床治療方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇78只6～8周齡的SPF級BALB/c健康雄性小鼠，體質量18～22 g。均由海南省疾病預防控制中心提供，動物使用許可證：SYXK(瓊)2015-0021。以基礎飼料適應性喂養1 w，室溫(25.0±2.0)℃，濕度55%～70%，自然光照，保持室內通風，避免噪音。

1.2動物模型制備與分組 采用簡單隨機抽樣方法將78只小鼠分為正常對照組(NC組，n=10)、空白對照組(BC組，n=10)及模型組(n=58)。各組小鼠適應性喂養1 w后，NC組與BC組給予常規飼料喂養及自由飲用純凈水，模型組則采用自由飲用質量分數為5%的葡聚糖硫酸鈉(DSS，購自美國Sigma-Aldrich公司)溶液以制備小鼠UC模型，持續7 d。每日觀察小鼠的糞便形狀、精神狀況及活動情況，記錄其體質量的變化等。造模結束后第2日隨機處死模型組小鼠3只，分離腹部結腸組織，以生理鹽水沖洗干凈后肉眼下觀察結腸是否充血水腫，并在顯微鏡下觀察其組織病理學改變。模型組造模成功的依據為：表現為稀便、大便帶血(或隱血陽性)或體重減輕的三種癥狀之一者，且結腸組織呈現一定程度的形態及組織病理學改變。本次成模的小鼠共58只，成功率為100%。后將剩余的55只成模小鼠隨機分為模型對照組(MC組，n=10)、雷公藤多苷低劑量組(LD組，n=15)、雷公藤多苷中劑量組(MD組，n=15)和雷公藤多苷高劑量組(HD組，n=15)，其中LD組、MD組和HD組分別灌胃給予劑量為9.01、27.03和81.09 mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷片(湖南千金協力藥業有限公司，規格：10 mg×50片，批準文號：國藥準字Z43020138)混懸液(以蒸餾水配制成0.45、1.35、4.05mg/ml)，而MC組、NC組及BC組均灌胃等量的生理鹽水，1次/d，均持續7 d。第22日，除NC組外，均給予其余5組小鼠腹腔注射100 μg脂多糖(LPS)，以激活TLR4/NF-κB信號通路并啟動下游炎癥因子的釋放，24 h后處死小鼠，剖腹剪取結腸組織，摘取肉眼下所見病變最明顯處的結腸組織，一部分用于制備組織切片進行病理學觀察，另一部分制成組織勻漿，-80℃凍存，待測。

1.3觀察指標與方法

1.3.1各組小鼠結腸組織的組織形態學評分 肉眼下觀察結腸組織中黏膜層及漿膜層的變化，切取距肛門約8 cm的遠端結腸組織，大小約為2.0 cm×2.0 cm，以10%的中性甲醛液固定24 h后行常規石蠟包埋，以切片機制成厚度3～4 μm的連續切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后在光學顯微鏡下觀察各組小鼠的結腸組織病理學表現。參照相關文獻〔7〕，對各組小鼠結腸組織的大體形態改變及組織病理學損傷進行評分。

1.3.2各組小鼠結腸組織中TLR4蛋白的表達 采用蛋白質印跡法檢測結腸組織勻漿中TLR4的表達水平，主要操作過程包括：取100 mg左右結腸組織，剪碎后加入適量冰磷酸鹽緩沖液(PBS)置于勻漿器中進行研磨，滴加蛋白裂解液和PMSF提取組織中的總蛋白。經上樣、電泳、轉膜后采用甲醇浸泡、緩沖液平衡、轉移、脫色等操作，后加入5%的脫脂奶粉進行封閉，4℃過夜后迅速加入一抗(TLR4小鼠單克隆抗體，以封閉液稀釋濃度為1∶500，晶美公司)，搖床孵育2 h，4℃過夜、TBS液洗滌4次，各10 min。加入二抗(以封閉液稀釋濃度為1∶2 000，晶美公司)，封閉、室溫搖床孵育1 h，TBS液洗滌4次，各10 min。加入底物孵育，清除硝酸纖維素膜，以蒸餾水漂洗、晾干，采用Fluor-s凝膠成像系統(環亞生物科技有限公司)分析目的蛋白條帶的灰度值，計算其相對含量。

1.3.3各組小鼠結腸組織中NF-κB p65的表達 采用免疫組化EnVision二步法進行檢測，主要操作有：將結腸組織切片進行脫蠟、水化、熱修復等處理后，滴入1滴3%的H2O2，室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物的活性。PBS沖洗3次，各3 min，晾干，滴加一抗(NF-κB p65兔多克隆抗體，濃度稀釋為1∶500，北京博奧森生物公司)，4℃靜置孵育1 h后，以PBS洗滌3次，各5 min；滴加山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G-辣根過氧化物酶(HRP)多聚體(稀釋倍數為1∶2 000，北京索萊寶科技有限公司)，搖床孵育40 min后，以蒸餾水洗滌3次，各5 min。每張切片滴加1滴新鮮配制的二氨基聯苯胺(DAB)液顯色3 min，顯微鏡下觀察5 min，流水沖洗終止顯色，蒸餾水漂洗后以蘇木素復染、0.1%HCl分化、梯度酒精脫水、中性樹膠封片。晾干后由2名經驗豐富的病理醫師采用盲法對切片結果進行判斷，評估方法參照相關文獻〔8〕，根據陽性細胞(即胞質或胞核呈黃色或棕色的細胞)所占百分比及其染色強度對免疫組化結果進行評分(IHC評分)。IHC評分越高，說明結腸組織中NF-κB p65的表達水平越高。

1.3.4各組小鼠結腸組織中促炎因子的表達 各組小鼠結腸組織中白細胞介素(IL)-1α、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-13的濃度檢測方法為酶聯免疫吸附法(ELISA)，操作過程主要有：剪取100 mg左右結腸組織，迅速置于液氮中冷卻，切成2～3 mm3的小塊，在組織勻漿器中加入預冷的50 mmol/L PBS液(pH6.0)進行研磨，在4℃超低溫高速離心機中進行離心，14 000 r/min離心10 min，分離上層液體，存于-80℃冰箱中。IL-1α、TNF-α、IL-13的測定嚴格按照ELISA試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)說明書進行。

1.4統計學方法 應用SPSS21.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1各組小鼠結腸組織的病理學表現及組織形態學評分比較 顯微鏡下對各組小鼠的結腸組織切片進行觀察，可見BC組及NC組結腸組織黏膜光滑、完整，腺體結構清晰，未見水腫、潰瘍及炎細胞浸潤等炎癥反應；MC組結腸組織呈典型的UC病理表現，即黏膜呈明顯充血水腫、糜爛、潰瘍等表現，潰瘍周邊腺體結構紊亂且異常增生，黏膜及黏膜下層可見淋巴細胞、漿細胞等炎性細胞浸潤；各組雷公藤多苷組小鼠結腸組織炎性改變較MC組呈現不同程度的減輕，LD組發生的炎癥反應較MD組及HD組更嚴重，HD組炎癥反應改善狀況最明顯。各組小鼠形態學評分結果示，各模型組小鼠的大體形態學評分及組織損傷評分均顯著高于BC組及NC組，差異有統計學意義(P<0.05)；而BC組與NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；各模型組小鼠中，LD組、MD組和HD組的評分均低于MC組，且HD組

2.2各組小鼠結腸組織中TLR4及NF-κB p65蛋白表達水平比較 各模型組小鼠結腸組織中的TLR4含量及NF-κB p65 IHC評分均顯著高于BC組和NC組，差異有統計學意義(P<0.05)；而BC組與NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；各模型組小鼠中，LD組、MD組和HD組的評分均低于MC組，且HD組

表1 各組小鼠結腸組織的組織形態學評分比較

與BC組及NC組比較:1)P<0.05；與MC組比較:2)P<0.05；與LD組比較:3)P<0.05；與MD組比較:4)P<0.05；下表同

表2 各組小鼠結腸組織中TLR4及NF-κB p65蛋白的表達水平及IL-1α、TNF-α、IL-13的濃度比較

2.3各組小鼠結腸組織中IL-1α、TNF-α、IL-13的濃度比較 各模型組小鼠結腸組織中IL-1α、TNF-α的濃度均高于BC組和NC組，差異有統計學意義(P<0.05)，而BC組和NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；各模型組小鼠中，LD組、MD組、HD組小鼠IL-1α、TNF-α濃度均低于MC組，且HD組0.05)。見表2。

3 討 論

UC是結直腸部位發生的一種自身免疫性疾病，病變呈彌漫性改變，多由直腸段開始，累及全段結腸，內鏡下可見腸壁黏膜多發性潰瘍、周圍組織充血水腫。患者多以病因不明且遷延不愈的腹痛、腹瀉、便血為主要臨床表現。據統計，隨著經濟的發展及居民飲食習慣等因素的改變，我國UC患病率已超過11.6/10萬，成為腸道主要疾病之一，且UC還可能參與結直腸癌的發生發展過程〔9〕。而目前臨床藥物對于UC的治療效果并不理想，且存在復發率高、不良反應多、不宜長期服用等缺陷〔10〕，雷公藤多苷是從中藥雷公藤中精煉分離得到的抗炎物質，主要由二萜內酯、生物堿及三萜內酯等生物學活性成分組成，素有“中草藥激素”之稱，在風濕、類風濕關節炎、腎小球腎炎、小兒紫癜等免疫性疾病的治療中發揮重要作用〔11〕。

目前對于UC的病因及發病機制尚不明確，學者普遍認為其發生發展涉及遺傳、地域、免疫、環境、腸道菌群、飲食習慣等多種因素〔12〕，其中免疫因素在其中發揮主導作用。近年來TLRs/NF-κB信號通路在各類變應性疾病發生機制中的作用成為學者們研究的焦點。TLRs是一類Ⅰ型細胞跨膜蛋白，廣泛表達于單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞中，也可表達于表皮細胞、成纖維細胞等非免疫細胞中。其可通過識別細菌、病毒等外源性配體及宿主自身釋放的熱休克蛋白、透明質酸等內源性配體，并與之結合，啟動細胞內的信號轉導途徑，調節細胞內的免疫平衡〔13〕。TLR4是首個被發現的TLRs，是介導內毒素/LPS發生應答反應的最重要受體。人類正常結腸上皮細胞中，TLR4呈低表達且TLR4信號通路中的關鍵共受體MD2不表達。因此正常腸黏膜對LPS呈低反應性；而當結腸黏膜出現炎癥反應時TLR4呈高表達狀態〔14〕。NF-κB是一類廣泛存在于人體細胞中的核轉錄因子，在人體的生長發育、炎癥反應、損傷修復等活動中發揮重要調控作用〔15〕。通常情況下其由P50和P65兩種亞基組成，其中P65是其主要活性成分。靜息狀態下，NF-κB與IκB-α以非共價鍵的形式結合，在細胞內以失活狀態存在；而當細胞受到外界刺激時，IκB激酶被激活并降解IκB蛋白，從而解離NF-κB與IκB-α的結合物，使NF-κB活化并轉移至細胞核內與靶基因DNA結合，進而發揮促進細胞增殖及炎癥因子釋放等多種生物學功能，炎癥因子的分泌與表達可進一步激活NF-κB，使其形成正反饋調節，放大炎癥反應〔16〕。

本實驗結果顯示說明雷公藤多苷對UC小鼠的結腸組織病理損傷具有顯著改善作用，且其改善作用與雷公藤多苷的劑量有關，高劑量組改善效果更為明顯。本文進一步對雷公藤多苷的作用機制進行研究，結果說明小鼠在UC狀態時，結腸黏膜的TLR4/NF-κB p65信號通路可被激活，從而促進其下游促炎癥因子的釋放；雷公藤多苷可對UC小鼠的TLR4/NF-κB p65信號通路產生抑制作用，下調其下游促炎癥因子，而對抗炎細胞因子IL-13不產生調控作用。

綜上所述，不同劑量雷公藤多苷可對UC小鼠的結腸組織損傷具有不同程度的保護作用，且高劑量組效果更顯著，而最佳適宜劑量仍需進一步研究。其保護作用機制可能與其對TLR4/NF-κB p65通路的抑制作用，進而下調其下游促炎癥因子IL-1α、TNF-α的分泌和表達有關。

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