人參入血成分對(duì)過(guò)氧化氫損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

朱 凱 張燚曼 馮 青 周 歡 呂宏亮 于智莘 李麗靜

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

心力衰竭存在著心肌缺血現(xiàn)象，心肌缺血時(shí)一般會(huì)發(fā)生復(fù)雜的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧自由基及其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化是造成心肌損傷的啟動(dòng)因素〔1〕。活性氧是一類(lèi)在細(xì)胞呼吸及代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧的單電子還原產(chǎn)物，一方面具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)等生理功能，另一方面過(guò)量的產(chǎn)生會(huì)引起生物大分子的過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的破壞，造成細(xì)胞壞死或凋亡等不可逆性細(xì)胞損傷。過(guò)氧化氫(H2O2)是一種可以對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷的活性氧(ROS)自由基。本文主要探討人參入血成分對(duì)H2O2損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 新生24～72 h乳鼠，健康SPF級(jí)SD大鼠，體重180～220 g，雌雄各半，由遼寧省長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)-2015-0001。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥 取新生72 h乳鼠心臟，將心肌組織進(jìn)行消化，差速貼壁后，用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性。細(xì)胞活力>95%的細(xì)胞進(jìn)行心肌細(xì)胞培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和搏動(dòng)情況。將細(xì)胞分為6組：(1)正常細(xì)胞組(Sham)：10%胎牛血清的DMEM；(2)H2O2損傷細(xì)胞組(H2O2)：含終濃度200 μmol/L H2O210%胎牛血清的DMEM；(3)人參入血成分含藥血清5 min組(SFP 5 min)：含終濃度為200 μmol/L H2O2的10% 5 min含藥血清的DMEM；(4)人參入血成分含藥血清10 min組(SFP 10 min)：含終濃度為200 μmol/L H2O2的10% 10 min含藥血清的DMEM；(5)入血成分2%組(SFY2%)：含終濃度為200 μmol/L H2O2的2%移行成分和10%胎牛血清的DMEM；(6)入血成分5%組(SFY5%)：含終濃度為200 μmol/L H2O2的5%移行成分和10%胎牛血清的DMEM。每孔加相應(yīng)溶液200 μl，作用1 h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3檢測(cè)指標(biāo) 利用MTT和CCK-8法檢測(cè)心肌細(xì)胞的存活率；利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(LDH)漏出量，心肌細(xì)胞丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力；利用熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣(〔Ca2+〕i)的含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌細(xì)胞存活率比較 與Sham組對(duì)比，H2O2組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.001);SFP 5 min組、SFP 10 min組、SFY2%組、SFY5%組心肌細(xì)胞存活率均顯著高于H2O2組(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組心肌細(xì)胞存活率比較

與H2O2組比較:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

2.2各組心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)頻率比較 加藥前，各組心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。加藥1 h、6 h，H2O2組自主搏動(dòng)頻率均顯著低于Sham組(均P<0.001)；SFP 5 min組、SFP 10 min組、SFY2%組、SFY5%組均顯著高于H2O2組(P<0.05,P<0.001)。加藥1 h，SFP 10 min組自主搏動(dòng)頻率顯著低于SFP 5 min組(P<0.01)；SFY5%組顯著高于SFY2%組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)頻率比較次/min)

與H2O2組比較：1)P<0.05，2)P<0.001；與SFP 5 min組比較：3)P<0.01；與SFY2%組比較：4)P<0.05

2.3各組LDH、MDA、SOD含量比較 與Sham組比較，H2O2組LDH和MDA含量明顯升高(P<0.001)，SOD含量明顯減少(P<0.001)。與H2O2組比較，SFP 5 min組、SFP 10 min組，SFY2%組、SFY5%組LDH、MDA含量顯著降低(P<0.01,P<0.001),SOD含量顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組心肌細(xì)胞LDH漏出量、MDA、SOD含量比較

與H2O2組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；與SFP 5 min組比較：4)P<0.01；與SFY2%組比較：5)P<0.05

2.4各組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Ca2+活性比較 與Sham組相比，H2O2組〔Ca2+〕i含量顯著升高，Na+-K+-ATP酶、Ca2+ATP酶活力顯著下降(P<0.001)；SFP 5 min組、SFP 10 min組、SFY2%組、SFY5%組〔Ca2+〕i含量均顯著低于H2O2組，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性均顯著高于H2O2組(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。SFP 10 min組〔Ca2+〕i顯著高于SFP 5 min組，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活力均顯著低于SFP 5 min組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組〔Ca2+〕i 、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性比較

與H2O2組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；與SFP 5 min組比較：4)P<0.05

3 討 論

ROS指化學(xué)性質(zhì)較活躍的含氧代謝物，是需氧細(xì)胞在有氧代謝過(guò)程中由氧分子(O2)或一氧化氮(NO)形成的副產(chǎn)物。ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。過(guò)量的ROS通過(guò)攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸，破壞心肌細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能，并促使線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，形成ROS激活與釋放的正反饋回路從而導(dǎo)致再灌注性心律失常、心肌頓抑、細(xì)胞凋亡與壞死等〔2〕。H2O2本是一種重要的ROS，可在Fe2+或Cu2+的作用下或H2O2均裂產(chǎn)生HO·〔3〕。SOD是人體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)之一，可以通過(guò)清除人體代謝中不斷產(chǎn)生的自由基，保護(hù)機(jī)體組織免受過(guò)氧化及自由基的損傷。SOD的活力可反映機(jī)體清除氧自由基的能力，其活性與心肌損傷程度呈負(fù)相關(guān)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化代謝的毒性終產(chǎn)物，其含量可以直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)度和速率，間接反映細(xì)胞受氧自由基損害的嚴(yán)重程度，其含量與心肌損傷程度呈正相關(guān)〔4〕。維持心臟的正常功能需要大量的能量。能量代謝是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展和惡化的重要因素之一。由于Ca2+參與心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)，具有增強(qiáng)心肌收縮力的作用，因此細(xì)胞內(nèi)鈣超載也能造成細(xì)胞收縮功能紊亂，影響心肌正常生理活動(dòng)和能量代謝，是心肌受損的主要機(jī)制之一。由此可見(jiàn)，抑制鈣超載對(duì)保護(hù)心肌細(xì)胞至關(guān)重要〔5～7〕。辛偉等〔8〕報(bào)道，增加Ca2+-ATP酶活性可以改善心肌細(xì)胞舒張功能及能量代謝，降低細(xì)胞耗氧量，并減弱心肌重塑和凋亡。

4 參考文獻(xiàn)

1吳青松.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶與Caspase-3 si-RNA構(gòu)建永生化人肝細(xì)胞株〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

2夏 強(qiáng)，錢(qián)令波.心腦缺血再灌注損傷的機(jī)制及防治策略研究進(jìn)展〔J〕.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2010；39(6)：551-7.

3Dhalla Ns，Elmoselhi AB，Hata T，etal.Status of myoeardial antioxidantsin isehemia-reperfusion injury〔J〕.Card Tol Res，2000；47(3)：446-56.

4黃志華，李良東，曾 靖，等.拳參正丁醇提取物對(duì)大鼠心肌肥厚時(shí)鈉鉀及鈣ATP酶活性的影響〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010；21(1)：122-3.

5胡元會(huì)，車(chē)維新，曹雪濱，等.心復(fù)康口服液對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)心衰模型心肌細(xì)胞Ca2+-ATPase及琥珀酸脫氫酶活性的影響〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2000；15(2)：31-3.

6徐菲飛，彭 成，王茁伉，等.參附注射液對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞 ATP 酶及相關(guān)離子的影響〔J〕.中藥藥理與臨床，2013；29(3)：19-21.

7羅明鳳，張三印，黃秀深，等.參附注射液和生脈注射液對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+-ATP酶影響的對(duì)比研究〔J〕.天津中醫(yī)藥，2008；25(6)：487-90

8辛 偉，李小鷹，魯曉春，等.心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶過(guò)表達(dá)對(duì)慢性缺血性心力衰竭小型豬心功能的改善作用〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011；36(4)：347-51.