弱激光促進糖尿病大鼠皮膚創傷愈合及對PI3K/Akt-HIF-1α信號系統的影響

農慶文 李順堂 劉達恩 吳亞軍

(廣西醫科大學第一附屬醫院燒傷整形科，廣西 南寧 530021)

糖尿病(DM)常伴隨血管病變，包括大血管和微血管病變。其中大血管病變常引起下肢疼痛和間歇性跛行，嚴重者導致肢體壞疽，多與大血管病變引起皮膚缺血性病變，引發潰瘍和感染相關。如何預防和治療DM相關的大血管病變是DM治療的重要內容〔1,2〕。弱激光對于創傷的治療自20世紀60年代開始至今，其療效飽受爭議，與弱激光的治療機制不明密切相關〔3〕。磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和缺氧誘導因子(HIF)-1α是具有多種功能的信號通路，功能包括細胞新陳代謝、大分子合成、細胞代謝(生長、增殖和凋亡)等〔4〕。研究顯示PI3K/Akt-HIF-1α信號系統可能參與2型DM創傷愈合相關〔5〕。本課題分析PI3K/Akt-HIF-1α信號系統在DM大鼠皮膚創傷愈合過程的表達，并分析不同劑量弱激光對于DM大鼠皮膚創傷愈合的作用和對其可能影響。

1 資料與方法

1.1受試動物 SD雄性大鼠100只，體重180～220 g，3～4月齡，廣西實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證證號：SCXK2014-0002。

1.2儀器和設備 血糖儀及配套血糖試紙(上海玉研科學儀器有限公司)；GL21M型高速低溫離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)。

1.3DM大鼠皮膚創傷模型制備 2%的鏈脲佐菌素50 mg/kg腹腔注射，72 h后尾靜脈取血，測血糖值，血糖≥16.8 mmol/L提示DM大鼠制備成功。大鼠采用水合氯醛麻醉，刮凈背部，常規消毒術野，以無菌手術剪在背部在脊柱左右對稱地剪開1 cm半徑的圓形皮膚創口，手術全程保持自然暴露。

1.4分組與給藥 將100只SD大鼠隨機分為5組：正常組、非DM皮膚創傷組、DM皮膚創傷組、弱激光低劑量組和弱激光高劑量組，20只/組。除正常組和非DM皮膚創傷組，其余組造模處理，非DM皮膚創傷組不制備DM模型，給予創傷處理。造模第2天給藥，正常組、非DM皮膚創傷組和DM皮膚創傷組不給予任何干預，弱激光低劑量組接受1.2 g·cm-2·6 min-1的弱激光照射，弱激光高劑量組接受3.6 g·cm-2·6 min-1的弱激光照射，連續照射7 d，創傷口以外部位避光處理。

1.5指標檢測 ①記錄創傷后1、3、7 d的創傷面積，分析各組創傷愈合情況。②記錄各組創傷后1、3、7 d的體重及隨機血糖。③HE染色。第8天，處死大鼠，沿窗口取邊緣約1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織，浸泡在40.0%甲醛溶液固定，常規石蠟切片，行HE染色。④Western印跡測定PI3K/Akt/HIF-1α信號通路蛋白。取約15 g皮膚勻漿裂解溶液，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，將蛋白轉到聚偏二氟乙烯膜，用封閉液 5%牛血清白蛋白的Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)在室溫封閉2 h，用TBST 1/1 000稀釋兔抗鼠 PI3K、Akt、HIF-1α和β-actin一抗，將膜置于一抗溶液中 4℃過夜。再將膜取出洗滌后置于TBST1/5 000辣根過氧化物酶(HRP)的二抗溶液中，4℃反應 2 h。洗膜、曝光，以β-actin蛋白為內參。

1.6統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件進行分析，計量資料采用方差分析，計數資料采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組不同時間皮膚創傷面積比較 隨著時間的延長，各組均有不同程度的愈合；與非DM皮膚創傷組比，DM皮膚創傷組愈合最慢(P<0.05)；與DM皮膚創傷組比，弱激光低劑量組創傷后7 d和高劑量組創傷后1、3、7 d愈合明顯(P<0.05)，見表1。

2.2各組不同時間體重和隨機血糖的比較 隨著時間的延長，各組體重具有不同程度的增高。對照組和非DM皮膚創傷組不同時間的體重和隨機血糖差異無統計學意義(P>0.05)；DM皮膚創傷組、弱激光低和高劑量組不同時間的體重和隨機血糖差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和非DM皮膚創傷組比，DM皮膚創傷組、弱激光低和高劑量組的體重明顯降低(P<0.05)，隨機血糖明顯增高(P<0.05)，見表2。

表1 各組不同時間皮膚創傷面積比較

與對照組比較：1)P<0.05，與非DM皮膚創傷組比較：2)P<0.05，與DM皮膚創傷組比較：3)P<0.05；下表同

表2 各組不同時間體重和隨機血糖的比較

2.3各組皮膚HE染色 對照組皮膚肌細胞排列整齊，非DM皮膚創傷組、DM皮膚創傷組和弱激光低劑量組均存在不同程度的橫紋肌壞死、肌纖維斷裂和明顯的嗜中性粒細胞浸潤，其中DM皮膚創傷組最嚴重，其次非DM皮膚創傷組和弱激光低劑量組，弱激光高劑量組恢復較好，僅存少量肌纖維斷裂。見圖1。

2.4各組皮膚PI3K/Akt/HIF-1α信號通路蛋白表達 對照組和DM皮膚創傷組PI3K、 Akt和 HIF-1α均呈弱表達，非DM皮膚創傷組PI3K、 Akt和 HIF-1α均呈強表達，與DM皮膚創傷組比，弱激光低和高劑量組PI3K、 Akt和 HIF-1α的表達均較強(P<0.05)，見圖2和表3。

圖1 各組皮膚HE染色(×100)

1.對照組，2.非DM皮膚創傷組，3.DM皮膚創傷組，4.弱激光低劑量組，5.弱激光高劑量組 圖2 各組皮膚 PI3K/Akt-HIF-1α信號通路蛋白表達

表3 各組皮膚 PI3K/Akt /HIF-1α信號通路蛋白表達

3 討 論

PI3K由一個調節亞基p85和一個催化亞基p110組成，主要功能使磷酸酰肌醇4,5-二磷酸磷酸化成第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸。在生長因素和(或)營養信號刺激下，PI3K作為上游激酶，磷酸化 Akt 位點，被激活的Akt 可抑制周期蛋白 D1降解，加快細胞周期G1/S1轉換，促進增殖相關基因mRNA轉錄。PI3K/Akt 信號通路激活可促進血管內皮祖細胞歸巢至缺血組織，促進血管再生，Akt敲除動物模型心血管系統因缺乏周細胞募集可導致層黏連蛋白沉積減少，血管基底膜變薄及血管成熟度降低。類似地，PI3K/AKT信號通路也可被PI3K抑制劑、ATP拮抗劑及二甲雙胍等阻斷，進而影響細胞增殖、擴散和血管生成等過程。本研究結果提示DM創傷皮膚的PI3K/Akt 信號通路處于受抑制狀態，血管內皮祖細胞難以運送至缺血組織，血管再生困難，該結果與文獻報道類似〔6～8〕。

PI3K/Akt 信號通路激活可活化HIF-1α表達相關的mRNA翻譯活化，上調HIF-1α表達。血管生成或再生是創面愈合的關鍵因素，血管可輸送營養與氧氣至創面，同時攜帶炎癥細胞與干細胞至創面。血管生成主要由低氧誘導，HIF-1α在調節細胞對低氧的反應，創面血管新生中起關鍵作用，包括內皮細胞活化、遷移和擴增，血管平滑肌細胞遷移和擴增，骨髓源性的成血管細胞動員、分化和擴增及基質重塑;調節特定的干細胞效應器。因為DM的創面微循環明顯受損，連帶內皮細胞的功能也受損〔8,9〕。

激光照射到皮膚組織，在皮膚組織內發生散射和吸收。本課題提示弱激光對血糖無明顯作用。但大鼠皮膚的PI3K、Akt和HIF-1α蛋白表達均有明顯提高，該結果與皮膚愈合、HE病理數據相吻合，且存在劑量依賴性關系，提示弱激光對DM性創傷有促進愈合的作用，其作用機制與激活PI3K/Akt-HIF-1α信號系統密切相關。文獻也顯示弱激光的作用靶點較多〔10～12〕：①能夠明顯減輕創傷的炎癥反應，加快成纖維細胞的增殖，促進膠原蛋白合成；②促進上皮細胞及毛細血管再生；③調整整體免疫系統，提高酶活性，增強脂質過氧化作用。上述促進愈合的機制均與激活PI3K/Akt-HIF-1α信號通路存在直接或間接的關聯。

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