整合素連接激酶在大鼠燒傷創面中的表達及對創面愈合的影響

姜 海 劉 宇 徐 剛

(唐山市工人醫院燒傷整形二科，河北 唐山 063000)

創面是指在熱力、外力、低溫、電流、化學物質、手術等外界致傷因子以及局部血液供應障礙等機體內在因素的作用下引起正常皮膚組織的丟失或出現皮膚完整性的中斷，并伴有皮膚功能損傷。皮膚受傷后發生一系列炎癥反應，真皮組織細胞分泌纖維連接蛋白和膠原等進行真皮組織重建和上皮組織再生〔1〕。整合素連接激酶(ILK)是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的一種，激活的ILK參與生長因子和整合素信號通路，對細胞凋亡、細胞遷移、細胞增生等多種細胞功能有調節作用，可以介導細胞外基質和細胞的相互作用〔2,3〕。研究發現ILK在心肌、肝臟、皮膚、神經纖維等組織器官損傷后的修復過程中發揮重要作用〔4,5〕。本文通過分析燒傷大鼠創面中ILK的表達水平及大鼠燒傷創面轉染ILK過表達慢病毒后對創傷愈合的影響，探討ILK在燒傷創面愈合中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 Wistar大鼠購自首都醫科大學實驗動物部，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、SP試劑盒、兔抗鼠ILK單克隆抗體(美國Sigma公司)，重組慢病毒載體(包含重組綠色熒光蛋白編碼基因和大鼠型ILK的cDNA片段)和不含ILK基因片段的空載慢病毒(上海吉凱基因公司構建)等。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠皮膚燒傷模型建立 將Wistar大鼠經戊巴比妥鈉腹腔麻醉成功后固定在燙傷儀上，將背部皮毛剔除，消毒背部皮膚，將80℃圓柱形燙頭垂直接觸Wistar大鼠背部兩側對稱皮膚致傷8 s建立大鼠燒傷模型；對照組大鼠不做任何處理。術后觀察創面的愈合情況。

1.2.2大鼠燒傷創面愈合過程中ILK表達測定 分別在燒傷后1、2、3 w隨機取7只燒傷模型大鼠，切取背部全層創面皮膚，對照組切取背部正常皮膚，用甲醛固定，石蠟包埋，切厚5 μm的切片，進行SP法免疫組化染色，以兔抗鼠ILK單克隆抗體為一抗，陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，具體步驟按照試劑盒說明書進行。結果分析，每個標本取7張切片，每張切片取7個高倍視野，采用Axio Vision顯微圖像采集系統拍攝圖片，采用Image-Proplus圖像分析軟件計算每個視野陽性表達的光密度值(平均光密度值=視野陽性表達積分光密度值/視野總面積)，蛋白表達強度和平均光密度值呈正比，平均光密度值越高蛋白水平越高。

1.2.3ILK質粒轉染293T細胞 取生長良好的293T細胞用胰蛋白酶進行消化，制成細胞懸液接種到24孔板上放回培養箱中培養，培養至細胞達85%融合時進行質粒轉染，具體轉染步驟按照轉染試劑說明書操作，并檢測質粒轉染率。

1.2.4大鼠的分組和處理 取燒傷大鼠隨機分為ILK轉染組、陰性對照組和空白對照組，ILK轉染組大鼠在燒傷后第2天于創面周圍及基底注射ILK過表達慢病毒液100 μl；陰性對照組大鼠在燒傷后第2天于創面周圍及基底注射空質粒慢病毒液100 μl；空白對照組大鼠于燒傷后第2天于創面周圍及基底注射等量生理鹽水。

1.2.5慢病毒轉染大鼠后組織綠色熒光檢測 燒傷后2 w，分別取ILK轉染組、陰性對照組大鼠各7只，處死后取相同部位背部創面皮膚，苦味酸標記處將創面組織切為厚10 μmol/L的切片，470 nm綠色激光下對創面組織的綠色熒光進行檢測。

1.2.6慢病毒轉染大鼠后ILK表達的檢測 分別取ILK轉染組、陰性對照組和空白對照組大鼠各21只，分別于燒傷后1、2、3 w每組各處死7只大鼠，取背部創面組織，采用免疫組化法測定組織ILK蛋白的平均光密度值，方法同上。

1.2.7ILK對大鼠燒傷創面愈合時間和愈合率的影響 分別取ILK轉染組、陰性對照組和空白對照組大鼠各7只觀察大鼠燒傷創面愈合時間和愈合率的影響，在燒傷后第1、2、3周對創面進行拍照，記錄創面愈合時間，采用Image J軟件分析各組大鼠創面面積，計算各組大鼠的創面愈合率，創面愈合率=(1-殘余創面面積)/原始創面面積×100。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數比較采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結 果

2.1燒傷創面愈合情況 燒傷后第3天創面開始收縮，1 w時壞死組織脫離，2 w時形成大量皮島，3 w時創面基本痊愈，所有大鼠創面愈合過程平穩，未見感染征象。

2.2大鼠燒傷創面愈合過程中ILK的表達情況 燒傷組燒傷后1 w(0.046±0.014)和2 w(0.057±0.020)燒傷創面ILK的光密度值高于對照組(0.012±0.003)(P<0.05)，燒傷后3 w(0.014±0.007)燒傷創面ILK光密度值和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3ILK質粒轉染293T細胞結果鑒定 目的基因質粒轉染293T細胞后24 h可以觀察到綠色熒光蛋白表達，轉染率為86.6%，表明ILK基因質粒轉染成功。見圖1。

圖1 ILK基因質粒轉染293T細胞(×100)

2.4慢病毒活體轉染后的表達情況 熒光顯微鏡下見創面冰凍切片中有綠色熒光蛋白表達，綠色熒光蛋白主要在皮膚基底層表達，部分毛囊中也可見綠色熒光蛋白表達。見圖2。

圖2 慢病毒轉染后創面熒光情況(×10)

2.5慢病毒轉染后各組大鼠創面組織ILK光密度值比較 燒傷后1、2 w，ILK轉染組創面組織ILK光密度值高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；燒傷后3 w，三組創面組織ILK光密度值比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 慢病毒轉染后各組大鼠創面組織ILK光密度值比較

與ILK轉染組比較:1)P<0.05

2.6ILK轉染后各組大鼠創面愈合率和愈合時間比較 燒傷后1、2 w，ILK轉染組創面愈合率高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；燒傷后3 w，三組創面愈合率比較差異無統計學意義(P>0.05)。ILK轉染組創面愈合時間〔(14.54±0.34)d〕短于空白對照組〔(17.98±0.46)d〕和陰性對照組〔(18.24±0.51)d〕(F=223.454，P<0.05)。見表2。

表2 ILK轉染后各組大鼠創面愈合率比較

與ILK轉染組比較:1)P<0.05

3 討 論

創面的愈合實質為受損組織完整性的重建，創面愈合包括炎性反應期、肉芽組織增殖期和細胞外基質重塑期，炎性反應期主要表現為炎癥介質的釋放和血管收縮；肉芽組織增殖期主要為血管生成、表皮細胞再生、纖維組織增生、纖維蛋白凝固；細胞外基質重塑期主要為皮膚組織彈性和抗拉強度的再形成和恢復〔6,7〕。整合素在創面愈合過程中發揮重要作用，其介導的信號通路對細胞周期、細胞增殖、細胞分化、細胞死亡等具有調控作用〔8〕；ILK在整合素介導的信號通路中發揮關鍵性的作用，在生長因子信號通路中，ILK也發揮重要作用，整合素和生長因子受體胞內信號通路胞內結構可以激活ILK，ILK被激活后通過多種途徑發揮激酶活性，參與細胞的調控〔9,10〕。ILK在腫瘤的發生和轉移、組織纖維化、組織損傷后修復等過程中發揮重要作用〔11,12〕。

ILK對細胞凋亡有抑制作用，其對細胞凋亡的抑制作用在腫瘤的發生發展中具有重要作用〔13〕，創面的愈合需要細胞的大量增殖，促進細胞增殖可以促進創面的愈合。本文結果發現，ILK在燒傷創面的愈合中發揮一定作用，ILK水平升高有利于促進燒傷創面的愈合。創面的修復包括真皮重構和表皮再生，真皮重構需要纖維細胞大量增生，纖維細胞分泌膠原等細胞外基質，從而完成真皮的重建；表皮再生過程中，汗腺、毛囊、基底層等處表皮干細胞首先出現增生，然后分化為表皮細胞，從而完成表皮的再生過程。ILK可能通過整合素信號通路調節燒傷創面細胞的增生，并在細胞外基質和細胞的相互作用中發揮作用，ILK表達水平升高促進細胞增殖、生長和分化，促進血管新生，從而促進創面的愈合〔14,15〕。

4 參考文獻

1Maquart FX,Monboisse JC.Extracellular matrix and wound healing〔J〕.Pathol Biol(Paris),2014;62(2):91-5.

2Zheng G,Zhang J,Zhao H,etal.α3 Integrin of cell-cell contact mediates kidney fibrosis by integrin-linked kinase in proximal tubular E-Cadherin deficient mice〔J〕.Am J Pathol,2016;186(7):1847-60.

3張奕霞,楊 煒,邱明磊,等.整合素連接激酶對人視網膜色素上皮細胞增殖的影響〔J〕.眼科新進展,2012;32(9):831-3,840.

4Gil D,Cioczyk-Wierzbicka D,Dulińska-Litewka J,etal.Integrin-linked kinase regulates cadherin switch in bladder cancer〔J〕.Tumour Biol,2016;37(11):15185-91.

5幸 宇,鄧世雄,齊 進,等.RNA干擾Tb人舌癌細胞整合素連接激酶基因表達可抑制移植瘤生長〔J〕.基礎醫學與臨床,2015;35(3):289-94.

6Teng M,Huang Y,Zhang H.Application of stems cells in wound healing--an update〔J〕.Wound Repair Regen,2014;22(2):151-60.

7Chattopadhyay S,Raines RT.Review collagen-based biomaterials for wound healing〔J〕.Biopolymers,2014;101(8):821-33.

8Song H,Liang W,Xu S,etal.A novel role for integrin-linked kinase in periodic mechanical stress-mediated ERK1/2 mitogenic signaling in rat chondrocytes〔J〕.Cell Biol Int,2016;40(7):832-9.

9Bhushan B,Edwards G,Desai A,etal.Liver-specific deletion of integrin-linked kinase in mice attenuates hepatotoxicity and improves liver regeneration after acetaminophen overdose〔J〕.Gene Expr,2016;17(1):35-45.

10Kudryashova TV,Goncharov DA,Pena A,etal.HIPPO-integrin-linked kinase cross-talk controls self-sustaining proliferation and survival in pulmonary hypertension〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2016;194(7):866-77.

11Pang MF,Siedlik MJ,Han S,etal.Tissue stiffness and hypoxia modulate the integrin-linked kinase ILK to control breast cancer stem-like cells〔J〕.Cancer Res,2016;76(18):5277-87.

12張書俊.整合素連接激酶、醌氧化還原酶-1和增殖細胞核抗原在肝細胞癌中的表達及意義〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(6):1511-3.

13Shen H,Ma JL,Zhang Y,etal.Integrin-linked kinase overexpression promotes epithelial-mesenchymal transition via nuclear factor-κB signaling in colorectal cancer cells〔J〕.World J Gastroenterol,2016;22(15):3969-77.

14Morgner J,Wickstr?m SA.The weakest link:a new paradigm for stabilizing the integrin-actin connection〔J〕.Cell Cycle,2013;12(18):2929-30.

15周日興,李葉揚,李 罡,等.整合素連接激酶信號通路在糖尿病大鼠皮膚病變及創面愈合中的作用〔J〕.中華燒傷雜志,2016;32(4):216-23.