小鼠壓力過負荷心衰心肌組織中轉化生子因子-β1、Ⅰ型膠原蛋白、α-平滑肌肌動蛋白及瞬時受體電位香草酸亞型4通道蛋白表達

安 君 成憲武 劉旭光 安 康 王 寧 高 健 張 凱

(延邊大學附屬醫院心臟中心，吉林 延吉 133000)

心力衰竭(HF)是多種心血管疾病進展的最終階段，世界范圍內HF發病率持續增加〔1〕,在壓力過負荷引起的HF約占心衰總人數的50%左右。多種機制參與HF心肌重塑過程，但其確切機制仍不甚清楚。迄今研究結果表明，細胞外基質沉積、心肌纖維化是HF發生、發展的最重要因素〔2〕。先前的研究表明壓力過負荷HF形成過程中IL-17A產生增多〔3〕，并通過上調基質金屬蛋白(MMP)2/9表達參與壓力過負荷HF心肌重塑。有報道轉化生子因子(TGF)-β1、Ⅰ型膠原蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)〔4，5〕參與心肌纖維化，而具有壓力敏感性的瞬時受體電位香草酸亞型4(TRPV4)通道具有壓力敏感性特點，可被流體壓力以及剪切力等多種刺激所激活后參與心肌成纖維細胞分化過程〔6〕，但這些因子在壓力過負荷HF中的作用機制不甚清楚。本研究通過已建立的壓力過負荷HF模型〔7〕,同步檢測TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白表達，探討上述因子蛋白在壓力過負荷HF形成過程中的表達及可能的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物和分組 實驗動物選用4周齡雄性昆明系小鼠，體重20～25 g，共27只，由吉林白求恩醫學院動物實驗中心提供。將小鼠(27 只)，隨機分為空白對照組(n=6)、假手術組(n=6)、心衰組(n=15，其中TGF-β1蛋白表達組5只、去Ⅰ型膠原蛋白表達組5只及α-SMA蛋白表達組5只)。

1.2小鼠壓力過負荷HF模型制備 按文獻〔8〕方法制備。假手術組的手術操作與模型制備組步驟完全相同，僅不用鉭夾夾閉。部分夾閉主動脈弓10 w后在相同麻醉下通過心臟超聲觀察左室舒張末期直徑、左室收縮末期直徑、左室后壁舒張末期厚度以及射血分數判斷是否形成HF，模型合格用于實驗〔7〕。

1.3實驗材料 兔抗TGF-β1多克隆抗體(稀釋1∶800)購自美國Biovision公司，兔抗鼠I型膠原蛋白(稀釋1∶1 000)、多克隆抗體購自英國AbD Serotec，鼠抗α-SMA單克隆抗體(稀釋1∶1 000)購自德國Boehringer Mannheim公司，兔抗TRPV4多克隆抗體(稀釋1∶800)購英國Abcam公司。β-actin(稀釋1∶5 000)購自德國Sigma-Aldrich公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(稀釋1∶1 000)購自武漢艾美捷科技有限公司，其余二抗(山羊抗兔，1∶1 000～1∶8 000)以及一抗稀釋液等購自國內公司。

1.4TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白表達檢測(Western印跡法) 分別抽提各組心臟組織的總蛋白，采用Bmdford法進行蛋白定量，制備好的蛋白樣品置-80℃冰箱保存備用。取20 μg蛋白上樣，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)后，轉膜。封閉液室溫封閉60 min，相應一抗 孵育4℃過夜，TBST洗膜10 min，3次，辣根過氧化物酶標記的二抗(室溫 90 min，TBST洗膜10 min，3次，加入新鮮配制HRP化學發光試劑，FcluroChem9900成像系統顯影。采用Quantity one軟件進行光密度分析，從β-actin或GAPDH 作內對照。

1.5統計學方法 應用 SPSS19.0 軟件行單因素ANOVA分析，兩組間用配對t檢驗。

2 結 果

2.1TGF-β1蛋白表達 小鼠壓力過負荷HF發生過程中心肌組織中的TGF-β1蛋白表達與正常及假手術組比較明顯增強(P<0.05)。見圖1。

2.2Ⅰ型膠原蛋白蛋白表達 小鼠壓力過負荷HF發生過程中心肌組織中的Ⅰ型膠原蛋白表達與正常及假手術組比較明顯增強(P<0.01)。見圖2。

2.3α-SMA蛋白表達 小鼠壓力過負荷HF發生過程中心肌組織中的α-SMA蛋白表達與正常及假手術組比較明顯增強(P<0.01)。見圖3。

1，空白對照組；2；假手術組；3，壓力過負荷心衰組；下圖同圖1 TGF-β1蛋白表達

圖2 Ⅰ型膠原蛋白表達

圖3 α-SMA蛋白表達

2.4TRPV4通道蛋白表達 小鼠壓力過負荷HF發生過程中心肌組織中的TRPV4通道蛋白表達與正常及假手術組比較明顯增強(P<0.01)。見圖4。

圖4 TRPV4通道蛋白表達

3 討 論

HF的病理基礎是心肌重塑，是多種常見心臟疾病向終末期心臟疾病發展的一個病理過程，是心臟功能由代償期向失代償期轉變,進而引起HF的關鍵。HF發生過程中細胞外基質沉積、心肌間質纖維化是HF發生、發展的最重要病理過程〔9〕。各種細胞因子通過不同途徑參與其細胞外基質沉積、心肌間質纖維化進最終導致HF。

TGF-β1作為一種多效性細胞因子，在誘導纖維化過程中起中心作用。已有報道高水平的血漿TGF-β1與中老年人心力衰竭風險增加相關〔4〕,而抑制TGF-β1可改善小鼠HF心肌重塑〔8〕。TGF-β1又可上調α-SMA mRNA 以及蛋白表達〔5〕。本研究結果表明壓力過負荷HF中TGF-β1蛋白表達明顯增加證明TGF-β1參與壓力過負荷HF形成過程。本研究表明Ⅰ型膠原蛋白以及α-SMA蛋白表達在壓力過負荷HF形成過程中增強，有報道稱TGF-β1可上調α-SMA mRNA以及蛋白表達以及Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白、MMP2/9等相關〔5〕。

近來具有感受壓力特點的TRPV4通道與心血管的調節以及疾病的關系越來越引起人們的重視〔6〕。本研究結果表明，在壓力過負荷HF過程中其TRPV4蛋白表達明顯增強，提示壓力過負荷HF發生時心臟壓力變化引起TRPV4蛋白表達增強。有報道稱阻斷TRPV4 可抑制TGF-β1誘導的肺水腫、HF以及肺動脈高壓的進展〔10〕。TRPV4又可通過整合來自TGF-β1信號和機械(壓力)因素調節心臟成纖維細胞分化成肌成纖維細胞〔6〕。既往報道與心肌纖維化和心臟重塑具有密切關系的IL-17A通過MMP2/9參與壓力過負荷HF形成過程〔3〕，而TGF-β1亦通過MMP2/9參與壓力過負荷HF形成過程〔5〕。IL-17A和TGF-β1在下游信號傳遞中可能具有某種交織，存在某種調控關系。有報道指出，IL-17A通過TRPV4介導參與機械性痛覺過敏〔10〕，但這種調節是否也存在于過負荷HF形成過程中尚不清楚。

本次同步檢測TGF-β1、 Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白在壓力過負荷HF心肌組織中表達增強的結果，提示這些細胞因子以及與HF相關的因子如IL-17A等相互調節機制在壓力過負荷HF形成過程中起重要作用，但其確切的機制尚不清楚。深入研究這些因子在細胞外基質沉積、心肌間質纖維化過程的作用，尤其在信息傳導層面的調節機制將有助于揭示HF發生機制。

4 參考文獻

1Seliger SL,Hong SN,Christenson RH,etal.High-Sensitive Cardiac Troponin T as an Early Biochemical Signature for Clinical and Subclinical Heart Failure:MESA (Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis)〔J〕.Circulation,2017;135(16):1494-505.

2Mehra MR,Naka Y,Uriel N,etal.A fully magnetically levitated circulatory pump for advanced heart failure〔J〕.N Engl J Med,2017;376(5):440-50.

3安 君,李永財,劉旭光,等.白介素-17A對壓力過負荷心衰小鼠的影響〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(3):1046-7.

4Glazer NL,Macy EM,Lumley T,etal.Transforming growth factor beta-1 and incidence of heart failure in older adults:the Cardiovascular Health Study〔J〕.Cytokine,2012;60(2):341-5.

5Zhang F,Dang Y,Li Y,etal.Cardiac Contractility Modulation Attenuate Myocardial Fibrosis by Inhibiting TGF-α1/Smad3 Signaling Pathway in a Rabbit Model of Chronic Heart Failure〔J〕.Cell Physiol Biochem,2016;39(1):294-302.

6Adapala RK,Thoppil RJ,Luther DJ,etal.TRPV4 channels mediate cardiac fibroblast differentiation by integrating mechanical and soluble signals〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2013;54:45-52.

7安 康,劉旭光,高 健,等.微創壓力超負荷小鼠心衰模型的建立〔J〕.中國胸心血管外科臨床雜志2016;23(11):1099-102.

8Luo J,Gao X,Peng L,etal.Effects of hydrochlorothiazide on cardiac remodeling in a rat model of myocardial infarction-induced congestive heart failure〔J〕.Eur J Pharmacol,2011;667(1-3):314-21.

9Randhawa PK,Jaggi AS.TRPV4 channels:physiological and pathological role in cardiovascular system〔J〕.Basic Res Cardiol,2015;110(6):54.

10Segond von Banchet G,Boettger MK,K?nig C,etal.Neuronal IL-17 receptor upregulates TRPV4 channel but not TRPV1 receptors in DRG neurons and mediates mechanical but not thermal hyperalgesia〔J〕.Mol Cell Neurosci,2013;52:152-60.