缺氧誘導因子2的結構與功能

李少瑛 吳靖芳 薛 剛

(河北北方學院臨床醫學2012級，河北 張家口 075000)

缺氧是腫瘤微環境的基本特征之一。局部缺氧時腫瘤細胞為了維持自身能量代謝，發生一系列適應性改變，如糖酵解增加、保護性應激蛋白〔如促紅細胞生成素(EPO)，血管內皮生長因子(VEGF)〕的表達增高等。通過激活和抑制促進腫瘤細胞存活、增殖、侵襲和疾病進展的一些基因來驅動癌細胞的生存和發展，在一些腫瘤中缺氧和缺氧誘導因子(HIF)與預后不良相關。HIF有HIF-1，HIF-2和HIF-3三種亞型。HIF-1表達于所有細胞中，是研究最廣泛且在腫瘤領域研究已較為成熟的。HIF-2在腫瘤中的研究相對較少。本文就HIF-2的結構、調節、表達及其在腫瘤中的作用機制進行綜述。

1 HIF-2的結構

HIF是由α和β兩種亞基組成的一種異源二聚體，α亞基是嚴格受氧濃度的調控的功能亞基；β亞基又稱芳香羥受體核轉運蛋白(ARNT)，組成性表達于細胞核，不受氧濃度影響，與保持HIF的結構穩定性及其二聚化后轉活化有關，所以HIF的研究主要集中在α亞基〔1，2〕。HIF-2最早是在1997年由Tian等〔3〕在內皮細胞克隆出來的，又名內皮PAS1蛋白(EPAS1)、組胺釋放因子(HRF)和HIF相似因子(HLF)等，與血管生長、骨髓造血、能量代謝、腫瘤發生發展密切相關〔4，5〕。人HIF-2α基因定位于2號染色體P16～21區，開放閱讀框架為607 bp編碼的869個氨基酸，分子質量為96.5 kb。由堿性螺旋-環-螺旋蛋白(bHLH)、PAS、氧依賴的降解結構域氧依賴的降解結構域(ODD)和轉錄激活結構域(TAD)結構域組成。N-端有bHLH、PAS-A和PAS-B三個結構域，與HIF-1α的同源性分別為99%、91%和96%〔6〕。在C-端，具有兩個轉錄激活結構域：氨基酸端激活域(NAD或NTAD)和羥基端激活域(CAD或CTAD)〔7，8〕。NTAD在HIF-2α調節不同靶基因的主要結構域〔7〕，而CTAD在缺氧條件下富集轉錄輔助激活因子，如p300/CBP〔 9，10〕。作為轉錄因子的HIF-2α，其蛋白中存在富含堿性氨基酸(Lys和Arg)片段的核定位信號(NLS)，NLS在缺氧時能夠特異性的定位在細胞核內。HIF-2α的氨基酸序列為NLS：KRQLEYEKQAFQDPSGGDPPGGSTSHLMWKR〔11〕。見圖1。

HIF-2α與HIF-1α均含有bHLH 和 PAS結構域，ODDs、NADs、CADs，百分數代表HIF-1α和HIF-2α各個結構中氨基酸的相似程度圖1 HIF-α結構示意

2 HIF-2α表達的調節

2.1HIF-2α基因水平調節 HIF-2α基因水平的調節研究較少，且在不同株細胞中表達差異較大。在小鼠胚胎HIF-2α mRNA幾乎只表達于內皮細胞中，因此HIF-2α又名EPAS1。基因水平上調節HIF-2α表達的因子較少，Narano-Suárez等〔12〕報道神經生長因子(NGF)可穩定抑制大鼠嗜鉻細胞瘤(PC)細胞中HIF-2α mRNA的表達，即使在放線菌素D存在的條件下仍無改變。骨橋蛋白抑制骨關節炎軟骨細胞內HIF-2α mRNA表達〔13〕。白細胞介素(IL)-1β可明顯上調心肌細胞HIF-2α mRNA的表達，且與時間、劑量相關〔14〕。神經母細胞瘤缺氧24 h HIF-2α mRNA和蛋白一致升高，至72 h達高峰，其下游VEGFA與之變化一致。RNAi介導的雌激素相關受體(ERR)α降低可導致常氧和低氧狀態神經母細胞瘤HIF-2α mRNA表達水平〔15〕。胰島素樣生長因子(IGF)2可以在轉錄水平和翻譯后促進神經母細胞瘤和未成熟的交感神經母細胞內HIF-2α高表達〔16〕。

2.2蛋白質水平調節 在蛋白質水平調節HIF-2α表達的因子中，缺氧是最主要的調節因子，如O2/脯氨酰羥化酶結構域(PHDs)/pVHL途徑較為經典。

常氧時，細胞中HIF-2α處于不斷被合成和降解的動態平衡中，半衰期很短。ODD結構域中特定的脯氨酸殘基Pro405和Pro531被脯氨酰羥化酶結構域(PHD)蛋白識別并羥基化，被羥化的ODD促進HIF-2α與E3泛素連接酶復合體的VHL結合為pVHL復合體，并富集elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素連接酶，導致HIF-α降解〔17〕。其中PHD是該降解途徑的關鍵酶。哺乳動物中PHD存在4種成員(PHD1、PHD2、PHD3和P4H-TM)。體外實驗表明，HIF-2α主要由PHD1和PHD3調節；而HIF-1α主要由PHD2調節，在體內HIF-1α降解的關鍵限速酶是PHD2〔18〕。當氧氣濃度低于2%時，HIF-α亞基的氧依賴降解途徑被抑制〔16，17〕。見圖2。

bHLH DNA結合域，PAS 結構域和TADs、PHDs。常氧條件下，特異性脯氨酸羥化酶PHD使405和531位脯氨酸殘基處于羥化狀態，HIF-2α與VHL結合為pVHL復合體，富集 E3 泛素連接酶，導致HIF-2α降解，Asp847位氨基酸被HIF-1α抑制因子(FIH-1)羥化，抑制CTAD與CBP/p300結合圖2 常氧情況HIF-2α結構示意

3 HIF-2α的轉錄激活

天冬氨酸羥化酶又稱為FIH-1，可調節HIF-α亞基的轉錄。FIH-1蛋白在所有組織，細胞表達水平相似，免疫組化顯示FIH-1穩定表達于細胞質。常氧情況下，FIH-1主要位于細胞質并能修飾和沉默HIF-α。體外培養細胞缺氧或缺氧模型并不改變其胞質表達〔19〕。FIH-1催化時需要氧氣和底物2-酮戊二酸。常氧時，FIH-1可以羥基化修飾人類HIF-2α的Asn847位點，阻止HIF-2α的CAD結構域富集共激活因子p300/CBP以抑制HIF的轉錄激活功能。而低氧時，由于O2不足，FIH-1未羥基化，HIF-2α可以富集p300/CBP及其他一些特定的輔助因子并與HIF-β結合形成有轉錄活性的復合體〔6,20,21〕。見圖3。

常氧時，FIH-1介導的羥化作用阻止CAD 結構域富集共激活因子p300/CBP，抑制HIF的轉錄激活功能；低氧時FIH-1不能催化CAD羥化，CBP/p300與CAD結合活化靶基因圖3 HIF-α轉錄激活示意

缺氧相關因子(HAF) 可以作為一種新的E3連接酶，與HIF-1α結合形成HIF-1α-E3-HAF復合體，與DNA上的HIF-2α結合促進HAF小泛素樣修飾蛋白(SUMO)蛋白質修飾的HIF-2α轉錄。HAF SUMO蛋白質修飾由缺氧誘導，而HAF介導HIF-1α降解不依賴于HAF SUMO蛋白質修飾。小鼠HAF過表達增加囊性腎癌(CRCC)生長和轉移，臨床上HAF過表達則與不良預后有關〔22〕。

此外，磷酸化、去乙酰化等都能對HIF-α 的轉錄功能進行調控。NAD+依賴性去乙酰化酶Sirtuin1(Sirt1)在缺氧情況下能活化HIF-2α，繼而導致蛋白酪氨酸磷酸酶受體(PTPR)Z1過表達〔23〕。在轉錄激活時，HIF與低氧反應元件(HRE)的結合不能啟動靶基因〔4〕。α亞基中的CTAD結構域對轉錄輔助激活因子的富集是必不可少的一步。p300/CBP是HIF-1和HIF-2 轉錄時共同的輔助激活因子，但細胞內還存在其他輔助激活因子〔8〕，如E26轉錄因子(ETS)轉錄因子家族中的ETS-1、轉錄激活因子ETS樣蛋白(ELK)-1及NF-κB必需調節蛋白(NEMO)〔24〕等均能與HIF-2α特異性結合，上調HIF-2α的轉錄。見圖4。

A.Ets家族與HIF-2α共同活化激活靶基因;B.獨立活化靶基因圖4 轉錄依賴功能

4 HIF-2的作用

4.1組織分布 HIF-2α表達于多個器官的實質和間質細胞，嚙齒動物暴露于系統性缺氧時，通過免疫組織化學法可以穩定觀察到腎間質細胞、肝細胞、十二指腸上皮細胞、心肌細胞和星形膠質細胞均有HIF-2α表達。體外研究〔25〕表明在氧張力較高的情況下HIF-2α比HIF-1α穩定，缺氧時HIF-2α mRNA變化不明顯，HIF-2α蛋白積累主要發生在翻譯后調節階段。在氧傳遞系統的組織和器官HIF-2α mRNA水平都特別高，如肺和心臟。缺氧引起HIF-2α蛋白穩定表達于肺的Ⅱ型肺泡細胞和肺內皮，而檢測不到HIF-1α表達。胚胎發育晚期肺內HIF-2α轉錄也調節肺的發育、HIF-2α還高表達于胚胎發育中的主動脈旁體(合成兒茶酚胺的重要位點)。分析心肌缺血HIF-α染色模式表明，急性反應的α亞基主要發生梗死組織周圍，包括心肌細胞、內皮細胞和巨噬細胞。隨著時間的推移遠處心肌可檢測HIF-2α。這些低氧誘導因子不同時空模式的表達表明，兩個α亞基可能是在組織缺氧適應性反應中獨特和互補的角色〔25〕。

4.2HIF-2α在腫瘤中的作用 HIFs是氧動態平衡的重要傳感器。恒定HIF活化是許多癌癥中的一個共同特征，并且日益成為被認為是治療性干預的靶基因〔26〕。HIF- 2α在骨關節炎的軟骨高于周圍正常軟骨，通過上調分解代謝基因〔如基質金屬蛋白酶(MMP)1，3，9，12和13〕的表達水平，HIF-2α在軟骨關節炎形成中有重要作用，所以可作為該病的治療靶點〔27〕。大多數實體腫瘤經常形成缺氧、低氧環境，導致快速增殖的腫瘤在腫瘤周圍形成新生血管，轉分化細胞和正常細胞主要是通過穩定HIF-1α和HIF-2α氧敏感α亞單位適應缺氧環境。HIF-2α通過與HRE結合而啟動靶基因表達，調節多個基因(如腎上腺髓質素、葡萄糖載體蛋白1、IL-6、脂肪細胞分化相關蛋白等)促進腫瘤細胞的存活、進展、細胞外基質重塑和細胞遷移、細胞周期調控、DNA損傷反應、增殖和凋亡等〔6〕。國外一些研究發現許多基因被HIF-2優先調節，包括CITED2、EPO、纖溶酶原激活物抑制物(PAI)-1、酪氨酸激酶基因(Tie2/TEK)、VEGF受體、脂氧合酶(LOX)和PTPRZ1基因，這是導致HIF-2特異性的機制〔20〕。

4.2.1HIF-2α與CITED2 HIF-2α和ELK1之間的相互作用使HIF-2優先激活CITED2。有對肝癌細胞的研究發現CITED2作為一個潛在的HCC腫瘤抑制基因〔28〕。CITED2是HCC內過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的一個直接效應基因。CITED2在腫瘤中的作用并不清楚，敲除CITED2，通過轉化生長因子(TGF)β1途徑降低MMP-9和細胞侵襲力增加缺氧誘導的乳腺癌細胞死亡；然而CITED2缺失可使結腸癌細胞侵襲力增加。Wang等〔29〕報道甲狀腺乳頭狀癌組織HIF-2與淋巴結轉移有關。另外，國外有研究發現在缺乏雌激素和他莫昔芬的情況下CITED2超表達促進乳腺癌細胞體外生長，表明CITED2水平升高可能導致腫瘤生長和雌激素治療耐受〔28〕。

4.2.2HIF-2α與PTPRZ1 PTPRZ1局限表達于中樞神經系統，在脫髓鞘病恢復中有重要作用。Wang等〔15〕研究表明HIF-1和HIF-2α基因活化分別上調不同基因，確認PTPRZ1可被HIF-2α優先上調6倍之多。研究發現大部分HIF-2激活PTPRZ1可以歸因于HRE4啟動子區域一個HRE反義鏈的序列-TACGCACGCACGA-，HIF-2α與PTPRZ1啟動子區的ELK1的E26基序優先結合激活PTPRZ1〔30〕。PTPRZ1在很多癌癥高表達，如肝癌、腎癌和神經母細胞瘤〔15，30〕。最近有報道表明PTPRZ1是也可由慢性氧化應激引起，在氧化應激下Sirt1可能通過增強HIF-2α活動，進而促進PTPRZ1的過度表達〔23〕。PTPRZ1及其配蛋白在人類膠質母細胞瘤過度表達，并有證據〔30〕表明，這些蛋白質在癌癥的發病機制中發揮重要作用。進一步證據表明小干擾RNA膠質母細胞瘤的HIF-2α基因，檢測PTPRZ1在體外和體內的PTPRZ1高表達。此外，PTPRZ1的單克隆抗體已被證明有延遲膠質母細胞瘤模型中腫瘤生長的作用〔31〕。

4.2.3HIF-2α與VEGF 腫瘤的過度增長使組織缺血、缺氧，導致HIF-2α過度的表達，激活多種信號轉導通路，如增殖和侵襲相關基因如cyclin D1、c-Myc和E-cadherin，LOX，CXCR4，TWIST等，增強實體腫瘤的侵襲性；促進血管和淋巴管新生相關基因，如血管內皮生長因子、紅細胞生成素，血管生成素與Tie-2 受體〔32〕。VEGF是HIF-2α優先調節的靶基因，HIF-2α激活其下游靶基因VEGF，主要通過與VEGF基因的增強子結合使VEGF mRNA的轉錄水平升高，上調VEGF的表達，繼而與血管內皮表面的VEGF受體結合，使VEGF mRNA和蛋白的表達量增加，從而誘導新生血管的生成，提高實體腫瘤適應低氧微環境，引發一系列腫瘤生物學行為〔33〕。HIF-2α和VEGF與腎癌的生長密切相關，shRNA沉默HIF-2α基因，VEGF在腎癌細胞株中低表達，證實VEGF為HIF-2α下游靶基因之一，可以誘導VEGF的表達。HIF-2α可能成為治療腎癌新的有效靶點〔34〕。

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