Acacia seyal膠的疏水肽共價鍵合及其產物的表面物理化學性能

侯楚楚， 崔武衛，， 吳勝芳， 夏詠梅*，

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫214122）

阿拉伯樹膠來源于豆科的金合歡樹的樹干滲出物，在陽光下干燥后形成具有一定色澤的無規則的略透明膠塊[1]，以Acacia senegal和Acacia seyal等樹種的產膠量最大。其中乳化性能較好的阿拉伯膠A.senegal（以下簡稱Sn）被廣泛地應用于各種水包油乳狀液體系中，也常被作為一種低熱量的水溶性膳食纖維，用于各種保健品和飲料中[2-10]。而阿拉伯膠A.seyal（以下簡稱Sy）由于其較差的乳化性能，相對價廉，其應用也受到限制。

Sy有著與Sn類似的單糖和氨基酸組成，但是Sy有著更大的相對分子質量，更高的分枝度和較低的特征黏度，并且蛋白質含量非常低，大部分的氨基酸殘基都位于樹膠大分子結構的內部[11-14]。Sn和Sy中均含有AGP（阿拉伯半乳聚糖蛋白復合物），AG（阿拉伯半乳聚糖）和GP（糖蛋白）3種成分，并且Sn中的AGP含量要比Sy中高得多[14]。Flindt等[11]發現在Sy和Sn的乳液體系中，吸附于油滴表面的成分是不同的。對于Sn來說，主要是具有高分子量的蛋白質成分（AGP），能夠緊密地吸附在油水界面上，疏水的多肽鏈吸附在油水界面上，與之相連的親水性多糖部分則伸入水相中，從而在油/水界面形成了粘彈性的膜，降低油水間的界面張力[15]；而對于Sy，高分子量的餾分難于吸附，而相對分子質量較低的蛋白質成分成為吸附在油滴上的主要成分，并且發現這部分的乳化性能遠遠不如AGP；與Ray等[16]得出的結論一致，指出蛋白質含量和相對分子質量較高的餾分的乳化性能最好。通過疏水多肽修飾強親水性的Sy，有望提高Sy中的蛋白質和AGP含量，增加其在油水界面的吸附從而來改善Sy的乳化性能，也可以彌補Sn產量有限和經濟成本高等缺陷，拓寬Sy的商業價值和應用空間[17-18]。

美拉德反應是基于蛋白質/多肽分子中的活性氨基和糖分子還原末端的羰基之間的羰氨反應，不需要添加催化劑，在相對溫和的條件下便能順利進行[19-20]。蛋白質和糖通過接枝形成的共聚物具有優越的乳化特性，熱穩定性，溶解性，抗氧化活性和界面粘彈性。

作者采用CHP通過美拉德反應修飾Sy，通過改變Sy的親疏水性來得到一種新型的親水膠體乳化劑，提高其在水包油乳液體系中的乳化活性。實驗考察了疏水肽修飾對接枝產物CHP-Sy的兩相分配系數，界面活性和界面粘彈性的影響；同時以Sn為參照，考察其在水包油乳液體系中的乳化活性和乳化穩定性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

阿拉伯膠（Acacia seyal，BR）：上海唐錦實業有限公司產品。

高效液相色譜儀（Waters 600）：美國Waters公司產品；紫外分光光度計（TU1901）：北京普析通用儀器有限責任公司產品；實驗室高剪切分散乳化均質機（OuHor）：上海歐河機械設備有限公司產品；高壓均質機（NS1001 L2K）：意大利尼魯索爾維產品；激光粒度分析儀（S3500）：美國Microtrac公司產品；光學接觸角測量儀（OCA 40）：北京東方德菲儀器有限公司產品；旋轉滴張力儀（SVT20N）：德國德菲儀器有限公司產品；流變儀（Discovery DHR-2）：美國TA儀器公司產品。

1.2 CHP的制備

室溫攪拌下將NaOH溶液 （2 mol/L）滴入酪蛋白和水的混合物中，直至體系pH恒定為7.0且酪蛋白溶解完全；將上述溶液置于恒溫循環水浴槽，50℃下10 min后往其中加入胰蛋白酶 （底物質量的1%），攪拌反應。水解至設定時間后（以便獲得不同水解度的肽），立即將該酶解液轉移至沸水浴中滅酶活10 min，冷卻到室溫后，用HCl溶液調溶液pH到等電點4.6，室溫下離心15 min（5 000 r/min），除去未水解的酪蛋白，保留上清液酪蛋白水解肽。

用正丁醇萃取酪蛋白水解液中的疏水性肽和氨基酸[29]。將上述上清液用等體積的正丁醇萃取二次。將醇相萃取液的正丁醇旋轉蒸發后真空干燥再凍干，得到的CHP密封貯藏于4℃備用。

酪蛋白水解肽和疏水肽的分子量分布用GPC檢測。樣品用流動相溶解 （5 mg/mL），10 000 r/min下離心15 min后，取上清液用 0.45 μm微孔過濾膜過濾后進樣測定。不同水解度（DH）的酪蛋白水解肽和疏水肽的相對分子質量分布見表1。

酪蛋白水解肽和疏水肽的氨基酸組成按照國標GB T18246-2000進行測定。稱取適量的蛋白質樣品于10 mL的水解管中，然后加入6 mL的6 mol/L鹽酸溶液進行酸水解，抽真空封管后，在 110℃水解 24 h，冷卻后洗滌定容，過濾，蒸干，用氨基酸自動分析儀進行氨基酸組成分析。不同水解度（DH）的酪蛋白水解肽和疏水肽的氨基酸組成分別見表2。

表1 不同水解度的酪蛋白水解肽和CHP的相對分子質量分布Table 1 Molecular weight distribution of casein hydrolysis peptide and hydrophobic peptide

表2 不同水解度（DH）的酪蛋白水解肽和疏水肽的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of hydrolyzed and hydrophobic peptide of casein %

1.3 CHP-Sy接枝物的制備

將1.2中獲得的CHP與Sy按1∶3比例溶于去離子水中，室溫下攪拌2 h分散均勻后凍干，然后將凍干產物磨成粉末后過80目篩。取適量上述粉末于培養皿中，將其放入到底部盛有飽和NaCl溶液的干燥器中，在60℃的烘箱中進行美拉德反應，3天后停止反應，得到不同接枝度的接枝產物，將得到的產物凍干后密封貯藏于4℃備用，接枝度的測定采用TNBS法。

1.4 分配系數

將CHP-Sy接枝物溶解在適量的去離子水中后，滴加HCl溶液，調節pH至4.6，使未參與反應的CHP 發生沉淀，離心（10 000 r/min，30 min） 取上清液，調 pH 至 7.0，透析（3.5×103）后進行冷凍干燥；將凍干物（0.1 g）溶于100 mL去離子水，加入等體積的無水乙醇后持續攪拌2 h，將沉淀完全后抽濾得到的濾渣復溶在去離子水中，冷凍干燥得到純度較高的接枝產物。測定Sy和不同水解度的CHP-Sy接枝物在兩相分配平衡后的氮濃度，以兩相氮濃度的比值（C醇相/C水相）來表示接枝物的分配系數K。

1.5 接枝物紅外光譜分析

溴化鉀壓片法測Sy和CHP（DH 1.5%）-Sy接枝物在除去未反應部分疏水肽前后的紅外光譜。

1.6 粘彈性

將適量的Sy分散于適量的磷酸鹽緩沖液中（pH 7.0，0.2 mol/L），充分攪拌 1 h并在 4℃下過夜以充分水化樣品，離心后保留上清液，此儲備液用于凝膠流變性質的測定，使用前在室溫下攪拌1 h后上樣。小振幅動態振蕩測量于DHR-2流變儀中進行。平行板直徑為40 mm，其間隙設置為 0.8 mm。將1mL樣品置于平板與探頭之間，除去過量的樣品。在平板邊緣添加一層薄硅油，防止水分的蒸發。設置相關參數，溫度維持在25℃，找尋線性粘彈區；在5%的應力下，對樣品（0.5%）進行頻率掃描（0.1～10 rad/s），記錄彈性模量 G′及粘性模量 G″隨頻率變化規律。

1.7 表面張力和界面張力

表面張力的測定用懸滴法，將樣品分別配制成一定濃度梯度的溶液，在測定前于25℃水浴中恒溫30 min，并用超純水對儀器進行校正。

界面張力用旋轉低界面張力儀進行測定，樣品質量濃度0.36 g/dL，振動頻率4 500 r/min，測定界面張力隨時間的變化（25℃）。

1.8 乳化能力和乳化穩定性

將適量樣品溶于0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）中，室溫下持續攪拌30 min后，往其中加入一定量的菜籽油，用實驗室快速組織搗碎機在10 000r/min 下均質 60 s后，離心 5 min（1 500 r/min），測定乳化層高度和乳液總高度。

將離心后的乳液，在80℃的水浴中恒溫30 min后，冷卻，再次離心，記錄此時乳化層高度和乳液總高度。

1.9 接枝物在水包油乳液體系中的粒徑分布

將接枝物分散在醋酸緩沖溶液中 （pH 4.0，0.1 mol/L），控制濃度為2.0%，并加入質量分數0.01%的疊氮化鈉為抗菌劑，在4℃下放置12 h，使其充分水化，離心30 min（5 000 r/min），然后慢慢地往該分散體中加入適量菜籽油，用快速搗碎機預均質2 min，然后在35 MPa下高壓均質3次，得到待測乳液。乳液的粒徑分布用激光粒度分析儀測定，設定連續相折射指數1.333，分散相折射指數1.466。

2 結果與討論

2.1 CHP-Sy接枝物的親水親油性

用正丁醇提取的CHP比之萃取前水解液中獲得的水解肽的相對分子質量相對較低且分布較廣（表1），疏水性氨基酸含量更多因而疏水性更強（表2）。非離子表面活性劑的親水親油性可用HLB值表征，但正丁醇/水兩相分配系數的適用對象相對而言可比性更寬泛。圖1表明接枝物的疏水性比Sy的高，但接枝物疏水性隨著接枝肽鏈CHP水解度的增大而減小，即實驗范圍內低水解度的接枝物具有更高的疏水性。這是因為隨著CHP水解程度的增大，能夠參與美拉德反應的活性氨基 （賴氨酸）的比例在不斷減少（表2），造成CHP與Sy的接枝度減小。

圖1 Sy和Sy接枝物的正丁醇/水分配系數Fig.1 Partition coefficient of Sy and grafts of Sy

2.2 接枝物紅外光譜圖

圖2是Sy，CHP （DH 1.5%）-Sy接枝物在除去未反應部分疏水肽前后的紅外光譜圖。由于Sy中的蛋白質含量非常低，Sy在酰胺Ⅰ帶 （1 700～1 600 cm-1）和酰胺Ⅱ帶（1 480～1 575 cm-1）幾乎沒有吸收，而除去未反應部分的疏水肽后，酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶仍有較明顯的吸收峰，說明有部分疏水肽確實與Sy發生了接枝反應。

圖2 Sy和CHP（DH 1.5%）-Sy接枝物在除去未反應部分疏水肽前后的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectrum of CHP（DH 1.5%）-Sy conjugates

2.3 CHP-Sy接枝物溶液的表/界面張力和界面粘彈性

從圖3中可以看到，與Sy相比，接枝物大大降低了表面張力和液液界面張力，并且接枝物降低表面張力和界面張力的能力隨著接枝物疏水性增高而增強。

圖3 Sy和CHP-Sy接枝物的表面張力和界面張力隨濃度的變化（25℃）Fig.3 Surface/Interface tension of Sy，casein and CHP-Sy conjugates as a function of concentration at 25℃

Sy及其接枝物質量分數范圍在0.5%～4%之間時，其黏度不隨剪切速率的增大而發生變化，存在著明顯的線性粘彈區，呈現出牛頓流體行為（圖4）。而Sy的粘性模量 G″在所選頻率區始終大于彈性模量 G′（圖5），說明0.5%的Sy溶液在氣液界面呈現出更明顯的粘性特征，并且兩種模量的變化在高頻區對頻率的依賴性比較大。而CHP（DH1.5%）-Sy接枝物的界面粘彈性特征升高，是因為DH 1.5%的CHP的溶解性要遠遠好于酪蛋白，其接枝物不僅水溶性好，而且有著較高的分配系數，有效結合了多肽的疏水性和多糖的親水性，增強了其界面活性，更多乳化劑分子緊密的吸附在界面層，從而導致界面粘彈性要好于單獨的Sy。

圖4 Sy的粘度隨剪切速率的變化Fig.4 Steady shear rate dependence of viscosity for Sy

圖5 彈性模量（a）和粘性模量（b）變化Fig.5 Mechanical spectra at of Sy，Casein-Sy （a） and DH 1.5%-Sy（b）

2.4 CHP-Sy接枝物在油/水乳狀液中的乳化行為

2.4.1 乳化能力和乳化穩定性 如圖6所示，Sy經不同水解度的疏水肽鏈接枝后，乳化能力和乳化穩定性有了明顯的增大，并且隨著CHP水解度的降低，接枝物對乳液的乳化能力和乳化穩定性均隨之增大，水解度為1.5%的CHP與Sy的接枝物的乳化能力與Sn非常接近，乳化能力從1%提高到44%。接枝物的乳化穩定性仍不及Sn，說明接枝物的結構改造仍有上升空間。

圖6 Sn，Sy，CHP，CHP-Sy的混合物和接枝物的乳化能力和乳化穩定性（pH=7.0，25℃）Fig.6 Emulsion capacity and stability of Sn，Sy，CHP，CHP-Sy mixtures and conjugates（pH=7.0，25 ℃）

2.4.2 乳液粒徑分布 用CHP-Acacia Seyal接枝物作為菜籽油/水乳狀液的乳化劑，在水包油乳液體系（菜籽油/水）中，接枝物的乳化性能超過Sy的但略遜于Sn的。并且疏水性強的接枝物能形成更小的乳液粒徑即具有更好的乳化活性，尤其是DH為1.5%的 CHP與 Sy的接枝產物，Sy經 CHP（DH 1.5%）接枝后，乳液的平均粒徑從5.66 μm減小到1.10 μm；但是DH 1.5%-Sy的接枝物所形成乳液的體積粒徑分布并沒有呈正態分布，進一步證實了接枝物的乳化穩定性不如Sn的，結果見圖7。

圖7 Sy，Sn，和DH-Sy接枝物制備得到的新鮮水包油乳狀液的體積粒徑分布（pH=4.0，25℃）Fig.7 Comparison of particle size distribution for fresh emulsions made from canola oil/water stabilized by Sy，Sn and DH-Sy conjugates at pH 4.0，25 ℃

3 結 語

用酪蛋白水解獲得的疏水性肽通過美拉德反應與強親水性的Acacia Seyal膠接枝，與獲得的接枝物與Acacia Seyal膠相比，其疏水性增強。實驗范圍內，接枝物降低表/界面張力的能力以及界面粘彈性均比Acacia Seyal膠增強，且隨著接枝物疏水性增強而增強。接枝物對菜籽油/水乳狀液的乳化能力（44.08%）最高可達到與Acacia Senegal膠相近的值（43.93%），為Acacia Seyal膠的約44倍；其乳化穩定性最高則為Acacia Seyal膠的約20倍，但只及Acacia Senegal膠的56%。

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