不同力學刺激對T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑及骨形成的影響

陳祥和, 彭海霞, 孫 朋, 李世昌

(1. 揚州大學 體育學院，江蘇 揚州 225127；2. 華東師范大學 “青少年健康評價與運動干預”教育部重點實驗室，上海 200241)

Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種內分泌代謝疾病，其發病與胰島素抵抗、胰島β細胞功能受損有關[1]。T2DM抑制成骨細胞(osteoblast, OB)分化產生及骨形成[2]。在生命醫學領域內，探究T2DM抑制OB分化產生和骨形成分子調控機制的相關研究較多，但其信號調控網絡仍不完善。轉化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β) /Smad是調控骨形成的重要途徑，該途徑被激活后可促進T2DM小鼠OB分化產生及骨形成，改善骨量和骨形態結構[3]。運動是改善骨代謝的重要手段，但不同方式的運動對骨產生的力學刺激方式(分為直接作用力和間接作用力，即地面對骨的反作用力和肌肉對骨的牽拉力)存在較大差異。研究發現，直接作用力促進骨形成的作用效果顯著優于間接作用力[4]。雖然有關運動改善T2DM骨代謝的研究較多[5-7]，但相關研究主要集中在骨密度、骨生物力學等骨表型指標上，有關不同力學刺激影響T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad信號途徑相關分子表達及骨形成的研究尚未見報道。本文利用游泳和下坡跑模擬對骨產生的間接作用力和直接作用力，對T2DM小鼠進行運動干預；探究T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑中相關分子表達和骨形成的變化以及不同力學刺激對TGF-β/Smad途徑中相關分子表達和骨形成的影響。

1 研究材料與方法

1.1實驗動物造模及分組40只4周齡的C57BL/6雄性小鼠購于上海西普爾-必凱公司(生產證號：SYXX(滬)2015-0011)，初始體質量為(19±0.24) g，適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組(ZC，10只)和T2DM造模組(30只)。T2DM造模組小鼠6周高脂膳食(繁殖鼠料質量分數為54.6%、豬油質量分數為16.9%、蔗糖質量分數為14.0%、酪蛋白質量分數為10.2%、預混料質量分數為2.1%、麥芽糊精質量分數為2.2%，購自上海斯萊克公司)喂養結束后空腹12 h，然后一次性注射80 mg/kg鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，TC組小鼠注射檸檬酸-檸檬酸鈉溶液。STZ注射結束2周后，小鼠空腹12 h后檢測其血糖濃度，凡血糖濃度≥8 mmol/L的為T2DM小鼠[8]，27只造模成功并隨機分為T2DM對照組(TC，n=9)、T2DM游泳組(TS，n=9)和T2DM下坡跑組(TD，n=9)。正常小鼠喂食普通飼料，T2DM小鼠繼續喂食高脂膳食，均自由飲水，晝夜比為1…1(動物倫理編號：M20150311)。

1.2實驗動物訓練方案利用游泳和下坡跑分別對TS組和TD組小鼠進行訓練，方案如下。游泳：將小鼠放于42 cm(長)×40 cm(寬)×36 cm(深)的容器中進行訓練，50 min/d，共計8周。第1周為適應性訓練，前2天每天訓練30 min，第3、第4天每天訓練40 min，第5、第6天每天訓練50 min，第2周開始進行正常訓練。下坡跑：速率為0.8 km/h，持續時間為50 min，坡度為-9°，6 d/周，共計8周。第1周為適應性訓練，前2天每天訓練30 min，第3、第4天每天訓練40 min，第5、第6天每天訓練50 min，第2周開始進行正常訓練。

1.3實驗動物取材取小鼠左后肢(去除肌肉等軟組織)，以備Micro CT檢測股骨遠端骨密度(bone mineral density, BMD)；取小鼠右側后肢骨用于股骨濕重和骨形態大小、相關細胞因子mRNA(股骨)和蛋白(脛骨)表達檢測；取骨髓間充質干細胞(bone marrow mechel stem cell, BMSCs)進行細胞原代培養并誘導其向OB分化，利用Alizarin Red染液對其骨形成能力進行檢測；取顱骨以備進行Alizarin Red染色。

1.4指標檢測

1.4.1 骨中相關細胞因子mRNA表達的檢測 取右側股骨，提取RNA并將其反轉為cDNA。按定量試劑盒標準步驟對TGF-β/Smad信號途徑及其下游靶基因mRNA表達進行檢測。引物序列利用Primer premer軟件進行設計，并由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物序列一覽

1.4.2 骨中相關蛋白表達的檢測 取右側脛骨，研磨后提取骨中蛋白，按二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)法檢測樣本的蛋白濃度，結束后利用PBS將所有樣本的蛋白水平調整到同一水平；然后進行變性、電泳、轉膜處理，結束后利用麗春紅進行染色，并按目的條帶相對分子質量的大小對聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜進行裁剪，經磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)清洗后用質量分數為5%的脫脂奶粉封閉條帶1～2 h，利用已稀釋好的Ⅰ抗(按1∶1 000的比例進行稀釋)4 ℃孵育過夜；然后進行TBST清洗，并利用Ⅱ抗于室溫孵育2 h，TBST洗膜；最后，利用Alpha凝膠成像系統對PVDF膜進行顯影拍照，利用Fluorchem FC2-WB軟件進行數據分析。

1.4.3 BMSCs分化產生OB的骨形成能力檢測 小鼠斷頸椎處死后于體積分數為75%的酒精中滅菌，利用剪刀、鑷子和紗布將小鼠后肢骨上軟組織清除干凈，然后轉至無菌臺中操作。在體積分數為75%的酒精中浸泡2～3 min，利用已滅菌的PBS清洗2遍。利用已滅菌剪刀剪除股骨和脛骨兩端，暴露骨髓腔，用10 mL注射器吸10 mL培養基并配以1 mL注射器的針頭，將骨髓沖到50 mL離心管中。完畢后，制備單細胞懸液。取1.5 mL EP管，將適量單細胞懸液加至1.5 mL EP管中，并加入紅細胞裂解液，靜止5 min后利用血細胞計數板進行計數。結束后，按50萬個/孔接于24孔板中。置于培養箱中，2～3 d換1次液(視細胞的生長狀況而定)，6 d后向培養基中加入維生素C(1000×)和β-甘油磷酸(100X)誘導BMSCs向OB分化，2～3 d換1次液，在分化的第14天，利用體積分數為4%的PFA固定OB，然后采用Alizarin Red染液染色，最后利用相機拍照。

1.4.4 顱骨骨形成能力的檢測 顱骨經PBS清洗后，在體積分數為4%的多聚甲醛中于4 ℃下固定24 h。結束后，分別用體積分數為0.1%的Triton-X100和PBST于4 ℃下透化24 h，結束后利用Alizarin Red染液進行染色，約30 min。染色結束，利用相機拍照，并利用Photoshop軟件截取人字縫位置，觀察骨形成能力的變化。

1.4.5 BMD檢測 取右側股骨，利用體積分數為4%的PFA固定24 h，然后用Skyscan Micro-CT系統(型號: 1076)按每幀18 μm的規格對股骨遠端進行掃描。結束后，利用CT An軟件獲取BMD數據。

1.4.6 股骨濕重和骨形態大小的檢測 取右側股骨并利用電子稱對股骨濕重進行稱量。利用游標卡尺對股骨長度、遠端矢/冠狀軸寬度、中間矢/冠狀軸寬度、近端矢/冠狀軸寬度等骨形態大小指標進行測量。

1.5數據統計利用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS 18.0對實驗檢測的數據進行統計、分析(ZC組和TC組進行獨立樣本t檢驗，TC組、TS組和TD組進行單因素方差分析)，P<0.05和P<0.01分別表示差異具有顯著性和差異具有非常顯著性。

2 研究結果

2.1不同力學刺激對T2DM小鼠骨中相關因子mRNA表達的影響由表2可知：與ZC組相比，TC組TGF-β(P<0.01)、Smad2(P<0.05)、Smad3(P<0.05)、Smad4(P<0.01)、Runx2(P<0.05)和Osx(P<0.01)mRNA表達顯著下調。與TC組相比，TS組TGF-β(P<0.05) 和Osx(P<0.01)mRNA表達顯著上調；TD組TGF-β(P<0.05)、Smad2(P<0.05)、Runx2(P<0.01)和Osx(P<0.01)mRNA表達顯著上調。與TS組相比，TD組Smad2(P<0.05)和Osx(P<0.05)mRNA表達顯著上調。

表2 不同力學刺激對相關因子mRNA表達的影響

注： 與ZC組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與TC組相比，★表示P<0.05，★★表示P<0.01；與TS組相比，●表示P<0.05；表3～表5同此

2.2不同力學刺激對T2DM小鼠骨中細胞因子蛋白表達的影響由圖1和表3可知：與ZC組相比，TC組p-Smad2(P<0.01)、p-Smad3(P<0.05)和Smad4(P<0.05)蛋白表達顯著下調；與TC組相比，TS組p-Smad2(P<0.01)和p-Smad3(P<0.05)蛋白表達上調，TD組p-Smad2(P<0.05)、p-Smad3(P<0.05)和Smad4(P<0.05)蛋白表達顯著上調；與TS組相比，TD組p-Smad2(P<0.05)、p-Smad3(P<0.05)和Smad4(P<0.05)蛋白表達亦顯著上調。

2.3不同力學刺激對T2DM小鼠OB和顱骨成骨能力的影響由圖2～圖3可見：與ZC組相比，TC組OB和顱骨的骨形成能力下降；與TC組相比，TS組OB的骨形成能力增強，TD組OB和顱骨的骨形成能力增強；與TS組相比，TD組OB和顱骨的骨形成能力增強。

圖1 不同力學刺激對T2DM小鼠骨中相關蛋白表達的影響

表3 不同力學刺激對相關因子蛋白表達的影響

圖2 不同力學刺激對T2DM小鼠OB的Alizarin Red染色結果的影響

圖3 不同力學刺激對T2DM小鼠顱骨Alizarin Red染色結果的影響

2.4不同力學刺激對T2DM小鼠股骨BMD的影響由表4可知：與ZC組相比，TC組松質骨BMD(P<0.01)和皮質骨BMD(P<0.01)顯著下降；與TC組相比，TD組松質骨BMD(P<0.01)顯著升高。

表4 不同力學刺激對股骨BMD的影響

2.5不同力學刺激對T2DM小鼠股骨濕重和骨形態的影響由圖4和表5可知：與ZC組小鼠相比，TC組股骨濕重(P<0.05)、股骨長度(P<0.05)、遠端矢狀面寬度(P<0.05)和遠端冠狀面寬度(P<0.01)均顯著下降；與TC組相比，TS組股骨濕重(P<0.01)顯著增加，TD組股骨濕重(P<0.01)、遠端冠狀軸寬度(P<0.01)和遠端矢狀軸寬度(P<0.01)均顯著升高；與TS組相比，TD組遠端矢狀軸寬度(P<0.05)顯著增加。

圖4 不同力學刺激對T2DM小鼠股骨的影響(×1)

表5 不同力學刺激對股骨濕重和骨形態大小的影響

3 討論

3.1不同力學刺激對T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑相關分子表達的影響骨形成具有增加骨量、改善骨組織形態結構等作用[9]。TGF-β/Smads途徑中的多肽因子——TGF-β， 通過與膜上絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(transforming growth factor-βreceptor II, TβR-II)結合并將其激活，然后活化TβR-I，進而磷酸化胞內Co-Smads(Smad2/3)。其與Smad4結合形成磷酸化信號傳導復合體后迅速入核，調控靶蛋白(Runx2、Osterix(Osx)等)表達，促進OB分化產生和骨形成，改善骨量和骨形態結構[10-11]。T2DM會抑制OB分化產生及骨形成，研究發現，TGF-β/Smads途徑在此過程中具有重要的調控作用[3]。Ghiraldini等[12]和Ehnert等[13]證實，T2DM病人骨折或骨折后修復延遲與骨中TGF-β表達下調密切有關。另有研究證實，T2DM大鼠骨量下降與骨中TGF-β/Smads途徑被抑制有關[14]。與ZC組相比，TC組TGF-β1、Smad2/3/4、Runx2和Osx mRNA及p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達均顯著下調。說明T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑及其靶基因表達被顯著抑制，這與前人的研究結果一致。這與T2DM小鼠機體內胰島素濃度降低，胰島素樣生長因子( insulin-like growth factor, IGF-1 )表達下調進而抑制骨中TGF-β/Smad信號途徑表達有關[15]。

運動作為促骨形成的有效方式，在改善T2DM人或動物骨量、骨組織形態結構等指標上的作用已被證實[5-7]。有關TGF-β/Smad信號途徑介導T2DM小鼠骨形成運動適應的相關研究尚鮮有報道。在本文中，TS組TGF-β1和Osx的mRNA及p-Smad2和p-Smad3的蛋白表達上調，TD組TGF-β1、Smad2、Runx2和Osx mRNA表達及p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達上調；與TS組相比，TD組Smad2和Osx的mRNA表達及p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達亦上調。這表明，下坡跑可顯著激活T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad信號途徑，且其效果優于游泳。分析以上結果的差異，與2種運動方式對骨產生的力學刺激方式不同密切相關[4]。下坡跑對T2DM小鼠骨產生的直接作用力可激活IGF-1表達，其表達上調可激活TGF-β/Smad信號途徑[16]。直接作用力亦可通過上調E-選擇素配體1(E-selectin ligand 1, ESL-1)表達進而激活TGF-β/Smad途徑及其靶基因Runx2、Osx等[17]。當MKP2/3表達下調后[18]，其基因序列上蘇氨酸和酪氨酸的脫磷酸化會活化Smad3，進而激活TGF-β/Smad途徑及Runx2和Osx表達[19]。有研究發現，直接的作用力亦可通過上調T2DM小鼠骨中miR-34a[20]和miR-27b[21]表達來激活TGF-β/Smad途徑及其靶基因。

3.2不同力學刺激對T2DM小鼠骨形成能力的影響OB由BMSCs分化產生，其能力增強后可改善BMD和骨組織形態結構[22]。T2DM可以抑制OB分化產生及骨形成，但目前這方面的相關研究較少。Park等[23]和徐飛等[24]的研究均證實，T2DM小鼠分化產生的OB數量及骨形成下降。與ZC組相比，TC組OB骨形成能力下降，且顱骨骨形成能力亦顯著下降。這說明T2DM會抑制小鼠骨形成能力，這與前人的研究結果一致。分析其原因，這與T2DM小鼠骨中TGF-β/Smads通路被抑制有關[10]。T2DM小鼠骨中BMP-2、BMP-4和BMP-7[25-26]表達下調及金屬轉運蛋白1(metal transfer protein 1,DMT1)、過氧化物酶體增殖激活物受體γ輔激活因子1(peroxidase body growth activated receptor gamma auxiliary 1, PGC-1α)等的表達變化[27]亦會抑制OB和顱骨骨形成能力密切相關。

運動可改善T2DM骨代謝，但有關不同力學刺激影響T2DM小鼠骨形成能力的相關研究尚鮮有報道。與TC組相比，TS組和TD組OB和顱骨骨形成能力均升高；與TS組相比，TD組OB和顱骨骨形成能力亦高。說明8周運動顯著提高了T2DM小鼠OB和顱骨骨形成能力，且下坡跑的作用效果優于游泳。這與游泳和下坡跑對T2DM小鼠骨產生的力學刺激方式密切相關[4]。下坡跑對T2DM小鼠骨產生的直接作用力通過激活TGF-β/Smads的途徑及其下游靶基因Runx2和Osx表達，促進成骨前體細胞向OB分化，增加骨形成能力[28]；并且，IGFs和BMP-2表達上調，Smad1/5/8磷酸化后與Smad4形成磷酸化基團入核激活下游靶基因Runx2和Osx表達，促進OB分化產生及骨形成能力[29-31]。直接作用力增強T2DM小鼠骨形成能力與脂肪細胞分泌減少的脂肪酸(FFAs)抑制ROS-ERK/P38 途徑，進而上調Runx2、ColA1和骨鈣素等的表達有關[32]。

3.3不同力學刺激對T2DM小鼠股骨BMD的影響BMD是評價骨代謝的最經典指標[33]，T2DM會使其顯著下降[34]，這方面的相關研究較多，在此不再贅述。與ZC組相比，TC組小鼠股骨松質骨和皮質骨BMD均顯著下降。分析其原因可知，這與T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑被抑制后骨形成能力下降，骨中Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣蛋白等有機質合成減少，鈣、磷等礦物質出現沉積障礙有關[35]。運動可顯著增加T2DM小鼠的BMD。Thongchote 等[36]的研究發現，60 min/d、5 d/周、12周的自主跑輪運動可以顯著提高T2DM小鼠股骨BMD。Frajacomo等[37]的研究也發現，與游泳組相比，抗阻訓練顯著提高了雄性T2DM小鼠股骨BMD。在本文中，TS組松質骨和皮質骨BMD變化不顯著，說明游泳對改善T2DM小鼠BMD的作用不明顯。而TD組松質骨BMD顯著升高，皮質骨BMD變化不明顯，說明下坡跑可以促進T2DM小鼠松質骨BMD提高，而對皮質骨作用不顯著。這與運動對骨的作用影響最先表現在松質骨上有關。分析不同運動對T2DM小鼠BMD的結果差異可知，下坡跑對T2DM小鼠骨產生的直接作用力可激活TGF-β/Smad途徑和BMPs/Smad途徑，從而提高OB的骨形成能力，使得分泌產生的Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣蛋白( steocalcin, OCN)、骨橋蛋白(bone sialoprotein, BSP)等為鈣、磷等無機質沉積提供場所，使得BMD顯著增加[38-40]。直接作用力還可通過激活T2DM小鼠骨中Wnt/β-catenin信號途徑[41]、抑制破骨細胞(osteoclast, OC)分化產生及其骨吸收功能[42]使BMD增加。

3.4不同力學刺激對T2DM小鼠股骨濕重和骨形態的影響骨濕重和骨形態大小是宏觀上評價骨代謝的重要指標，T2DM骨代謝紊亂會導致骨濕重和骨形態大小顯著下降[43-45]。在本文中，TC組小鼠股骨長度和濕重均顯著下降，這與前人的研究結果一致，這說明T2DM會導致小鼠骨濕重和骨形態大小顯著下降。這與本文中T2DM小鼠骨形成能力下降后松質骨和皮質骨BMD下降有關[46]。運動可提高骨濕重和骨形態大小，但有關其作用于T2DM小鼠的相關研究較少。在本文中，與TC組相比，TS組股骨濕重顯著增加，TD組濕重、中間矢狀軸寬度、遠端冠狀軸寬度和遠端矢狀軸寬度均顯著升高，說明下坡跑和游泳均可顯著提高股骨濕重，這是因為游泳和下坡跑均可促進T2DM小鼠骨形成，提高BMD并增加骨濕重[47]。下坡跑改善T2DM小鼠骨濕重和骨形態大小的作用優于游泳，這與直接作用力激活TGF-β/Smad途徑，促進OB合成分泌Col1、OCN等有機質，利于鈣、磷等礦物質沉積有關[38]。直接作用力亦可通過抑制T2DM小鼠骨中Sclerostin和Dkk1表達、激活Wnt/β-catenin途徑、促進OB分化產生及骨形成能力等途徑使骨濕重和骨形態大小增加[48]。

4 結論

T2DM小鼠骨形成被顯著抑制，而下坡跑對T2DM小鼠骨產生的直接作用力可通過激活TGF-β/Smad途徑來提高骨形成能力，增加BMD，改善骨濕重和形態結構，且其效果優于游泳產生的間接作用力。

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