3D培養技術在細胞培養中的應用

竇毅鵬

摘 要：細胞培養是研究體內細胞在體外生物學行為的重要的研究手段。傳統的細胞培養是在培養皿或培養瓶的二維平面上進行的，這與細胞在體內所處的三維生長環境有著很大的區別。三維（3D）培養則是一種可以使細胞在體外條件下在進行三維生長的培養方法，可以更好地模擬細胞在體內的生長狀況及環境。在三維培養條件下細胞的許多生物學行為與傳統的二維培養有著很大的不同，其應用領域也有更廣泛的擴張，具有重要的研究意義。本文將對三維細胞培養的發展、特點及應用進行簡要的綜述。

關鍵詞：3D 細胞培養 體外培養 支架技術

中圖分類號：Q813 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）01（c）-0247-02

1 3D細胞培養的發展過程

自從四十多年前常規真核細胞培養出現以來，支持細胞生長的最常見的物質為聚苯乙烯或玻璃，細胞在其平坦的二維表面可以進行生長。應用這種細胞貼壁培養的方法，已經有成千上萬的關于腫瘤細胞或正常細胞生物行為的研究被發表。然而，對這些研究所基于的一個主要假設是，體外單層培養的細胞可以再現生物細胞在體內的生理學行為。顯然，在二維的玻璃或聚苯乙烯底物上生長的真核細胞并不能準確地反映出自然條件下組織中細胞的生長及與細胞外基質的準確的相互作用。

已經有研究發現，在體外培養條件下所觀察到的許多復雜的生物學反應如受體表達、RNA轉錄、細胞遷移和細胞凋亡等與在體內器官或組織中所觀察到的并不相同。從正常的細胞分裂、細胞增殖到細胞遷移及細胞凋亡等細胞生物學行為都是需要依賴于空間和時間的精確調控。相比之下二維的細胞的培養方法則相對簡單，忽略了這些已知的對細胞生長和組織生理學的精確調控有重要意義的參數。這其中包括機械力的信號、細胞與細胞基質之間的信號傳遞以及相鄰細胞微環境之間的信號溝通。特別是在細胞間信號傳遞方面，許多二維培養實驗未考慮不同細胞類型之間的相互作用，絕大多數培養物是單一細胞類型。雖然隨著研究方法的發展，二維培養部分程度地克服了這些缺陷中的一些，但在準確再現組織內觀察到的細胞功能方面還有一些欠缺。

針對這些問題，為了更好的模擬體內的細胞生長模式，研究者們通過各種努力，開發出了許多方法使得細胞可以在體外進行三維條件下的生長，也就是3D培養。最初的一個簡單的出發點是將細胞引入多孔生物相容性支架，是細胞在支架中進行生長。然而，3D系統的復雜性隨著許多參數的考慮而變得明顯。其中就包括對不同材料支架的選擇、細胞的來源以及實際的培養方法等，根據這些因素的不同，對于不同組織來源的細胞所進行的3D培養方法也具有很大差異。隨著研究的不斷深入目前已經有根據特定細胞所設計的不同的3D培養條件。并且在不同的細胞生物學行為實驗中有著不同的應用。

2 3D細胞培養的分類

一般來說，三維培養可分為有支架技術和無支架技術兩種。這兩種培養模式在不同的研究中具有應用。

2.1 支架技術

細胞支架技術又可根據使用的支架材料的不同分為用固體支架，水凝膠和其他材料。其中水凝膠技術是應用的最為廣泛的一種。因為天然的細胞外基質在細胞的存活、增殖、分化以及遷移中均扮演著重要的角色，而不同成分的水凝膠被認為是用來模擬不同天然細胞外基質的較為理想的材料。3D培養所用的水凝膠由具有高保水性的相互連接的孔組成，其中包含了各種細胞生長所需的營養素和氣體。來自天然和合成材料的幾種不同類型的水凝膠均可用于3D細胞培養，例如動物細胞外基質提取物水凝膠、蛋白質水凝膠、肽水凝膠、聚合物水凝膠及木基納米纖維素水凝膠等。

處理水凝膠支架外許多其他的材料也都在被嘗試用于細胞的3D培養，例如，使用天然來源或合成材料作為支架，使用自體或成體干細胞作為支架，以及使用精確的納米結構材料作為支架，更有研究應用具有近似幾何形狀的微結構支架以維持細胞生長。

2.2 無支架技術

無支架技術是另一種獨立于支架技術的3D細胞培養方法。無支架的培養方法包括使用低粘附細胞培養板、懸滴培養板、微圖案表面和旋轉生物反應器以及磁懸浮和磁性3D生物打印等。其中生物反應器是較新也較為復雜的一種培養裝置。用于三維細胞培養的生物反應器是小型塑料圓柱形腔室，專門設計用于三維培養細胞。生物反應器使用生物活性合成材料，如聚對苯二甲酸乙二醇酯膜，在維持高水平營養的環境中包圍球狀細胞。這一裝置可以很容易打開和關閉，使細胞球體可以用于實驗測試，但同時細胞培養的環境能夠保持100%的濕度，這個濕度對于獲得最佳的細胞生長狀態和完整的細胞功能具有重要意義。單個的生物反應器室被組裝入更大的裝置中，可以使其旋轉，從而確保在三個維度上的每個方向上的細胞生長狀況相同。

3 3D細胞培養的應用

在活體組織中，細胞存在于三維微環境中，具有復雜的細胞-細胞和細胞-基質相互作用以及復雜的營養物質和細胞的運輸動力學。常規的二維或單層細胞培養不足以代表這種環境，這往往使得它們不能作為體內藥物療效和毒性預測指標篩選的實驗方法。因此3D細胞培養越來越多地被用于藥物毒理學篩選。另外，3D細胞培養具有比二維細胞培養更高的穩定性和更長的壽命。在2D中，細胞必須定期進行胰蛋白酶消化，以便為細胞正常生長提供充足的營養，而3D環境還可以使細胞不受干擾地生長，三維球體已經在實驗室環境中養殖長達302d，同時仍然保持健康的非癌性生長。這意味著他們更適合長期研究和證明藥物的長期效應。

在研究細胞間信號傳遞以及細胞外基質與細胞的相互作用方面，3D球狀體更接近體內組織。3D培養基質可以幫助細胞能夠在其球體內移動，類似于細胞在活組織中移動的方式。因此，3D培養也是研究細胞遷移、分化以及存活和生長的理想模型。此外，三維細胞培養可以提供更精確的細胞極化描述，而在2D中，細胞只能部分極化。并且，3D培養可以實現對細胞外機械力信號傳遞的研究。而在細胞基因功能研究方面，在3D中生長的細胞表現出與在2D中生長的細胞不同的基因表達，在3D中生長的體外細胞的基因表達比2D更具有應用價值，因為3D球狀體的基因表達將更接近于體內的基因表達。

綜上所述，3D細胞培養與傳統二維培養具有很多優勢，是一種能夠更好模擬體內環境的培養方法，并且正處在快速的方法革新過程之中。同時，這一方法的建立也需要相對復雜的條件及技術。目前，3D培養技術在腫瘤藥物的研發、細胞生物學行為以及基因功能的研究方面均表現出重要的價值，因此，掌握這一方法對今后細胞生物學行為的研究具有重要的意義。

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