油葵轉基因方法的比較

焦 展， 安勝軍， 邵鐵梅， 李 雪， 劉 培

(1.河北化工醫藥職業技術學院/河北省高校生物反應器與蛋白類藥物開發應用技術研發中心，河北石家莊 050026；2.河北中醫學院，河北石家莊 050091)

油用向日葵(HelianthusannuusL.)別稱油葵，是重要的油料作物之一。向日葵基因轉化研究中較成功的方法多是以離體培養為基礎的農桿菌介導法，外植體包括莖尖、成熟胚子葉、下胚軸、未成熟胚、原生質體等[1-7]；而關于油葵的轉化研究相對很少[8]。另外，受基因型限制，再生率低、抗性愈傷分化率低、生根難導致獲得完整轉化植株困難，基因槍轉化穩定整合率較低，且極易發生早花——這些離體培養中的問題嚴重限制了向日葵尤其是油葵的遺傳轉化研究進程。因此，本試驗借助GUS組織化學染色，分別對油葵的去1張子葉轉化法和溫室子葉節轉化法、花粉管通道柱頭滴加轉化方法和子房注射轉化方法進行比較研究，驗證了簡便易行且效率較高的油葵轉基因方法。同時，這些轉化方法最低限度涉及或者完全不涉及離體培養，避免發生離體早花現象，能夠獲得完整的轉化植株。本研究為優化油葵轉基因體系提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以羅馬尼亞油葵“精選”恢復系為試材，由河北省半干旱研究中心河北華豐種業惠贈。GUS基因轉化試驗所用雙元表達載體為pBI121：：GUS，根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為LBA4404，均由本實驗室保存；含胰島素基因的植物表達載體pBINOI由本實驗室構建并保存[9]。

1.2 方法

1.2.1 農桿菌懸菌液的制備 接種農桿菌單菌落于液體YEB(5 mL)中。200 r/min、28 ℃振蕩培養過夜，再次接種于100 mL液體YEB中(接種比例1 ∶100)，繼續振蕩8～16 h。離心(4 000 r/min、4 ℃、10 min)收集菌體，用pH值7.0的MS液體(含100 μmol/L乙酰丁香酮)重懸，備用。

1.2.2 去1張子葉轉化法 挑選飽滿的油葵種子約150粒，用無菌水浸泡過夜。在超凈臺上去殼后放入無菌瓶，用75%乙醇消毒50 s，后用5% NaClO消毒9 min，無菌水沖洗4～5次，每次1 min，最后加入1/2MS液體。封好瓶口放于搖床，130 r/min、27 ℃振蕩培養一定時間。振蕩培養時間設6個處理，即0、6、12、24、36、48 h，重復3次。

用無菌手術刀在萌發種子的子葉節部位斜切，并在解剖鏡下去掉2張已萌發的幼葉和可見的葉原基，露出生長點部位(可借助解剖鏡保證去除隱藏的幼葉)，并用注射器針頭刺傷該區域，將該部分作為外植體備用。

侵染和培養方法參照RAO的方法[10]并加以改進。用含GUS基因的LBA4404農桿菌懸菌液浸泡侵染外植體30 min，隨后用無菌濾紙吸干水分，放置于1/2MS固體培養基，共培養3 d。

1.2.3 溫室子葉節轉化法(別稱溫室莖尖轉化法) 溫室苗床播種油葵種子，待幼苗萌發后，2張子葉微張至約60°角時，用手術刀片于子葉節部位斜切去除1張子葉，或從2張子葉中間生長點部位縱切，使生長點裸露，并用注射器針頭刺傷(可借助解剖鏡保證去除隱藏的幼葉)。將制備好的懸菌液用注射器注入生長點部位，并用脫脂棉沾濕菌液覆于生長點部位3 d，保持黑暗并每天噴水保濕。3 d后摘掉無菌棉，光周期16 h/8 h培養至長出2～3張新的完整葉片。由于操作部位為子葉節區域，而侵染部位位于莖尖附近，因此本研究中溫室子葉節轉化法別稱溫室莖尖轉化法。

1.2.4 質粒提取方法 質粒的提取方法參照文獻[11]。導入液終濃度約為100 ng/μL，-20 ℃保存。操作時質粒須冰浴保存。

1.2.5 花粉管通道柱頭滴加轉化法 對管狀花進行人工授粉，1～9 h后剪掉萎蔫的柱頭，用微量進樣器將質粒DNA溶液滴加到花柱上，每次5 μL，滴加3次。操作完成后用保鮮袋保濕2 h，隨花盤開放每天由外而內操作，直至最內層的管狀花開放完畢。授粉后減掉柱頭的時間設1、3、5、7、9 h等5個處理，種子收獲后統計結實率(結實率=結實小花數/操作小花數×100%)，后代經PCR檢測統計植株陽性率(植株PCR陽性率=PCR陽性植株數/該代植株總數×100%)。

1.2.6 花粉管通道子房注射轉化法 在人工授粉24～36 h后，撕開花冠和花絲筒，使子房暴露，針刺子房頂部正中部位，將25 μL微量進樣器伸入子房，注射DNA溶液10 μL，重復3次。其他方面(保濕、操作順序、結實率和陽性率)同柱頭滴加法。

1.2.7 GUS基因表達的組織化學染色分析 利用pBI121：：GUS質粒進行花粉管通道轉化，3 d后進行GUS組織染色，并觀察幼胚染色情況。28 d后進行后代種子染色，觀察種子染色情況。同時，設陰性對照(非轉化的同步材料)，觀察染色(染色方法及配方參照Jefferson的方法[12])情況。

1.2.8 轉胰島素基因油葵的PCR檢測 方法比較完成后，使用含有胰島素基因的LBA4404農桿菌菌株(載體結構見參考文獻[9])，再次侵染去1張子葉外植體，3 d后轉入MS+70 mg/L卡那霉素+300 mg/L頭孢噻肟鈉進行篩選。15 d后將抗性植株(根保留較多的)移栽入蛭石，或者將抗性芽進行嫁接(砧木采用2周齡同品種油葵幼苗)，以得到完整抗性植株，取植株上部新長出的葉片提取基因組進行PCR檢測。PCR陽性植株上收獲種子，播種長出T1代植株取新鮮葉片進行基因組提取，并進行PCR檢測。進行溫室子葉節轉化，轉化后取植株上部新長出的葉片提取基因組，進行PCR檢測收獲陽性植株種子，播種長出T1代植株取新鮮葉片提取基因組，并進行PCR檢測。提取含胰島素的基因的質粒進行花粉管通道柱頭滴加或子房注射轉化。進行轉化的植株(T0代)收獲的種子播種長出新植株(T1代)，取T1代鮮嫩葉片提取基因組進行PCR檢測，其引物為：上游5′-CGGGGTACCTCG TCTAAATTTCAGCCTATCGACG-3′，下游5′-CGAGCTCTTA GTTGCAGTAATTTTCTAG-3′。

1.2.9 數據統計與分析 數據用Excel 2010和分析軟件DPS 7.05處理，顯著水平0.05。

2 結果與分析

2.1 利用GUS組織染色比較去1張子葉和溫室子葉節轉化效率

由于去1張子葉轉化法和溫室子葉節轉化法2種方法的轉化原理和被侵染材料類似，首先比較這2種方法的轉化效果。用含GUS基因的農桿菌轉化去1張子葉實生株和子葉微張的溫室幼苗(溫室子葉節轉化)。對轉化后的材料進行GUS組織化學染色。參考文獻[13]擬定3個級別：Ⅰ級，GUS染色程度深，著色位點在子葉節及莖尖周圍，藍色部分連成片狀，面積超過分生區的2/3；Ⅱ級，GUS染色程度一般，在莖尖區域及其周圍有許多藍色著色位點；Ⅲ級，GUS染色程度很淺，僅個別部位有零星藍色斑點(圖1)。2種方法各選用100個幼苗作為侵染材料(重復3次)，侵染后3 d對侵染材料進行GUS組織化學染色。分別統計處于各染色級別的外植體的數目，各級別GUS瞬時表達率=相應級別的GUS瞬時表達著色材料數/侵染材料總數×100%；總GUS瞬時表達率=GUS瞬時表達著色材料總數/侵染材料總數×100%。結果表明，通過去1張子葉侵染方法得到的轉化材料明顯多于通過溫室子葉節轉化方法得到的材料。去1張子葉侵染方法得到的GUS瞬時表達效率可達41.20%，而后者僅為13.36%(表1)。圖2為去1張子葉轉化法得到的GUS染色陽性植株(3 d)。因此，在后序研究中多采用農桿菌介導的去1張子葉轉化方法進行侵染，并作為轉化胰島素基因的主要方法之一。

2.2 利用GUS組織染色比較柱頭滴加法和子房注射法的轉化效率

利用pBI121：：GUS質粒進行花粉管通道法轉化。同上，利用組織化學染色的方法對2種方法的GUS基因的3 d后瞬時表達效率進行比較，擬定3個級別：Ⅰ級，GUS染色程度深，整個幼胚都著色；Ⅱ級，GUS染色程度一般，著色部位約占幼胚1/2；Ⅲ級，GUS染色程度很淺，僅≤1/3面積的幼胚能夠著色(圖3)。結果發現，柱頭滴加法GUS表達效率明顯高于子房注射法，分別為17.33%、9.33%(表2)。此外，經柱頭滴加法進行花粉管通道轉化油葵28 d后取未成熟胚進行組織染色，可觀察到轉化材料可被染為藍色(圖4)。說明GUS基因在油葵種子上不僅轉化后3 d能夠瞬時表達，而且轉化后 28 d 也能夠表達，28 d表達率分別為11.92%、3.98%，差異顯著(表3)。因此，油葵花粉管通道法轉基因方法中柱頭滴加法優于子房注射法。

2.3 轉胰島素基因油葵的獲得

2.3.1 4種轉化方法轉胰島素基因油葵的PCR檢測 本試驗研究的4種方法都獲得了轉胰島素基因PCR陽性植株(圖5)，去1張子葉法和花粉管通道法比較適宜，其余2種方法也能夠獲得轉基因PCR陽性植株，但從轉化率方面和操作簡便易行方面優選去1張子葉轉化和花粉管通道轉化的方式，作為后續研究油葵的主要轉化方式。

表1 2種轉化方法材料的GUS瞬時表達效率比較(去1張子葉轉化法和溫室子葉節轉化法)

2.3.2 去1張子葉法T0和T1代轉胰島素基因油葵的獲得 去1張子葉法轉化油葵，轉化操作時間點的選擇對轉化效率影響很大。結果(圖6)表明，種子萌發后36 h對萌發的種子切去1張子葉，然后進行農桿菌侵染，轉化后抗性率和陽性率明顯高于其他處理，分別為12.83%、3.17%。

表2 2種轉化方法材料的GUS瞬時表達效率比較(柱頭滴加法和子房注射法)

表3 柱頭滴加法和子房注射法轉化后3、30 d材料的GUS表達效率比較

供試的600株去1張子葉無菌苗經農桿菌侵染、篩選、移栽或嫁接，共得到40株完整抗性植株(T0代)，經檢測得到19株T0代陽性植株(表4)，PCR檢測轉化率可達到 3.17%。培養過程中，由于離體培養的部分植株瘦弱，生根困難，移栽后很難成活。針對此問題，將嫁接的方法應用于本研究中，即使是無根組培苗，通過嫁接也可得到完整植株。但是，因嫁接成活率和抗性植株強壯程度不確定，得到完整抗性植株數量仍然較少。從T0代植株上收獲種子，播種長出T1代植株，取其幼嫩葉片提取基因組，PCR結果顯示，8個T0代陽性植株的后代均檢測到陽性T1代植株。但該方法由于侵染和培養過程中對幼苗有傷害，T0代植株得到的種子量較少，每株植株僅5～30粒種子。

2.3.3 花粉管通道法(柱頭滴加法)轉胰島素基因油葵的獲得 利用花粉管通道柱頭滴加轉化法轉化600朵小花，結實率可達52.83%，轉化率為10.83%(表5)。為獲得更高的轉化效率，本試驗研究了人工授粉后柱頭剪切時間對結實率和轉化率的影響。結果表明，授粉后5～9 h結實率、5～7 h轉化率均顯著高于其他處理(圖7)。綜合考慮，授粉后5～7 h是花粉管通道柱頭滴加法最佳操作時間，利用此方法對油葵進行轉化，可獲得轉胰島素基因油葵陽性植株(圖8)。此方法也可作為油葵轉基因研究的主要技術方法之一。

表4 農桿菌介導的去1張子葉侵染法對油葵的轉化

表5 花粉管通道(柱頭滴加法)對油葵的轉化

3 討論與結論

利用GUS組織化學染色的方法可以方便直觀地分析轉基因效果，這在前人研究中已有報道[13-14]。本研究也利用這種方法篩選出適宜油葵基因轉化的方法，而后續研究證明花粉管通道柱頭滴加轉化法和去1張子葉轉化法是油葵轉基因切實可行的方法，并由此得到了轉化植株和后代。

有研究發現，溫室子葉節轉化法在大豆轉基因研究中的效果良好[14]。而本研究發現去1張子葉轉化法優于子葉節轉化法，其原因可能是種子萌發的過程中，在無菌條件下更容易把握去除成熟胚生長點的時機。而溫室條件下，種子萌發過程須要拱土，這需要2～3 d的時間。試驗發現，當種子萌發后，多數生長點已經長出幼葉，錯失了拔除生長點的有利時機。因此，對于油葵轉基因來說，去1張子葉轉化法更為適宜。然而受限于轉基因植株本身的生理狀況，去1張子葉轉化法所得到的種子數量有限，這給后代遺傳分析和純系的篩選會造成不利影響。這些問題有待進一步解決。

本研究發現，對于花粉管通道的2種方法而言，柱頭滴加法優于子房注射法，原因可能是油葵小花數目多，尺寸小，子房相對較小，而且管狀花的構造不利于找準子房位置，給操作帶來不便；且子房注射法對子房和胚珠有不同程度的傷害，影響結實率，這和前人的研究觀點[15-18]一致。對于柱頭滴加法，操作時間對結果影響很大，時間太短花粉管沒有生長，則質粒DNA無法隨花粉管導入，時間太長受精已經完成，也失去導入時機。本研究發現，對油葵花粉管通道柱頭滴加法轉化時機應選擇人工授粉后5～7 h，結實率和轉化率均較高。

本試驗利用GUS組織化學染色的方法比較了4種油葵轉基因方法的效果，并通過轉化胰島素基因對轉化方法進行了驗證，優選出去1張子葉轉化法和花粉管通道轉化法，這2種方法可作為后續研究油葵的主要技術手段，可為向日葵等菊科植物基因工程育種研究提供技術方法的參考。

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