煙草莖點(diǎn)病在貴州省的發(fā)生及病原鑒定

江 艷， 桑維鈞， 曾爾玲， 王 勇， 王德鳳， 覃 可

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽 50025； 2.貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025)

煙草約于17世紀(jì)初傳入我國[1-2]，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。煙草行業(yè)在世界各產(chǎn)煙國經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位，我國更是世界上的煙草產(chǎn)銷大國。在生產(chǎn)上，煙草病害是制約煙葉產(chǎn)量提高的重要因素。至2002年，已報(bào)道的煙草病害有116種，其中侵染性病害有79種，非侵染性病害37種[3-4]。2016年7月筆者于貴州大學(xué)煙草實(shí)習(xí)基地及貴州省遵義市播州區(qū)樂山鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)疑似煙草莖點(diǎn)病，但目前對該病害的報(bào)道不多[5-8]。鑒于此，本研究對該病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，并經(jīng)柯赫氏法則對其致病性進(jìn)行驗(yàn)證，分析其rDNA-ITS及LSU基因序列，以明確煙草莖點(diǎn)病的致病菌，為煙草莖點(diǎn)病后期的相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀觀察

2016年7月通過對貴州省多個(gè)主要產(chǎn)煙區(qū)煙草病害的調(diào)查及采樣，于貴州大學(xué)煙草實(shí)習(xí)基地及貴州省遵義市播州區(qū)樂山鎮(zhèn)K326上發(fā)現(xiàn)煙草莖點(diǎn)病，采集具有典型癥狀的煙株莖稈，觀察并記錄病害癥狀。

1.2 病原菌的分離、純化及形態(tài)特征觀察

將所采病莖放在體視顯微鏡下觀察并挑取單個(gè)分生孢子器，置于無菌水中制成孢子懸浮液，涂布到水瓊脂(WA)平板上。挑取單孢接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)2～3 d，然后進(jìn)行純化保存，之后轉(zhuǎn)入試管中置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｈ绻麊捂咦硬婚L菌落，則直接挑取單個(gè)分生孢子器接種到平板上進(jìn)行分離。

將保存好的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫避光培養(yǎng)7 d，觀察記錄菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性，觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)，并測量其大小，參照文獻(xiàn)[9-14]確定煙草莖點(diǎn)病菌的分類地位。

1.3 病原菌的致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，對分離得到的菌株進(jìn)行致病性測定。選取K326健康的伸根期和旺長期煙株，用經(jīng)滅菌后的接種針刺傷莖稈以造成傷口。刮取在PDA平板上生長7 d的菌絲，接種于2個(gè)生長期的莖稈傷口處，同時(shí)以不接菌絲為對照。將生長7 d的菌落用打孔器打取直徑為5 mm的菌絲圓片，接種于葉片上，同時(shí)以無菌的PDA培養(yǎng)基圓片為對照。莖稈和葉片均用塑料袋保濕48 h，置于28 ℃人工氣候箱中。接種48 h后移去菌絲和菌絲圓片。定期觀察并記載發(fā)病情況和癥狀特點(diǎn)，對病組織進(jìn)行鏡檢并再次分離，觀察描述病原菌的形態(tài)特征，確定致病菌。

1.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

參照Cubero等的方法[15]提取菌絲的總DNA。采用引物ITS1/ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′)、LROR/LROR5(5′-ACCCGCTGA ACT TAAGC-3′/5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)對菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得ITS、LSU2段基因。

擴(kuò)增ITS基因的PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增LSU基因的PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，48 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊膠糖凝膠電泳檢測后送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。采用MAFFT[16]對病原菌的ITS和LSU序列與在GenBank下載的相關(guān)序列進(jìn)行比對。為實(shí)現(xiàn)排序匹配的最優(yōu)化，采用手工校對。比對后的序列采用MrBayes 3.1.2[17]軟件以貝葉斯法[18]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草莖點(diǎn)病癥狀觀察

田間觀察發(fā)現(xiàn)，該病害多發(fā)生在煙株的生育后期，主要危害莖稈部位。發(fā)病初期在煙株莖桿上形成邊緣明顯的近橢圓形或不規(guī)則形灰白色或褐色病斑(圖1-A)，病斑稍凹陷、粗糙。發(fā)病后期多個(gè)病斑融合成長條潰瘍，有時(shí)甚至擴(kuò)展至頂部，病部凹陷，上面密生小黑點(diǎn)，即為病菌的分生孢子器(圖1-B)。病重時(shí)莖部組織大面積干枯，造成水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸受阻，影響葉片的產(chǎn)量和品質(zhì)。病菌易從打頂抹杈和采葉傷口處侵入。

2.2 病原菌培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

病菌在PDA、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)和燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)上生長良好，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，菌落直徑分別為4.5、3.7、4.6 cm。由圖2可知，菌落在PDA培養(yǎng)基上呈圓形或近圓形，邊緣整齊，菌落菌絲細(xì)長且密，初期菌絲白色，后變成灰褐色，菌落邊緣為白色。26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)6 d可產(chǎn)生大量分生孢子器。分生孢子器散生或聚生，褐色，橢圓形或近球形，器壁薄且內(nèi)壁無色，有孔口，具乳突，大小為82.72 μm×243.93 μm～91.12 μm×255.12 μm。產(chǎn)孢細(xì)胞由分生孢子器內(nèi)壁細(xì)胞生出，呈瓶梗狀，透明。分生孢子無色透明，單胞，有1～2個(gè)油球，無隔膜，近圓柱形或橢圓形，壁薄，無附屬物，大小為1.55 μm×3.39 μm～2.82 μm×5.50 μm。

2.3 病原菌致病性測定

由圖3可知，采用菌絲接種盆栽伸根期和旺長期的煙株莖稈7 d后，均出現(xiàn)明顯的病斑。伸根期病斑為淺灰色至淺褐色，粗糙且凹陷，病斑隨后逐漸擴(kuò)大，回接所產(chǎn)生的癥狀與田間癥狀一致，但短期內(nèi)未在病斑處產(chǎn)生分生孢子器。將 5 mm 菌絲圓片接種于伸根期和旺長期葉片，6 d后均在葉片上形成明顯病斑，病斑黃褐色，近圓形或不規(guī)則形，病斑邊緣有黃色暈圈。病斑處較薄、質(zhì)脆、易破，部分病斑擴(kuò)大連成片。從接種發(fā)病的莖稈及葉片上再次分離的病原菌與原接種菌株形態(tài)相同，表明接種菌株為致病菌。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對煙草莖點(diǎn)病菌株HGUP8001的ITS和LSU序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得528、856 bp的片段。將測序得到的序列提交至GenBank(登錄號(hào)為：ITS，MF192850；LSU，MF192851)。利用Blast進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示與HGUP8001的ITS基因序列同源性達(dá)99%的菌株均為莖點(diǎn)霉，進(jìn)一步比對LSU基因序列，也與多個(gè)莖點(diǎn)酶屬菌株同源性為99%，表明HGUP8001菌株屬于莖點(diǎn)霉屬真菌。圖4系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，煙草莖點(diǎn)病菌株與廣生莖點(diǎn)酶(P.omnivirensCBS 654.77、P.omnivirensCBS991.95)聚在一起，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征將其鑒定為廣生莖點(diǎn)霉。

3 結(jié)論與討論

本研究于2016年7月在貴州省2地發(fā)現(xiàn)煙草莖點(diǎn)病，分離得到病原菌，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法將病原菌確定為廣生莖點(diǎn)霉。該病害僅在吉林[5-6，8]、陜西[7]2省有過報(bào)道，目前尚未有在貴州省發(fā)生的相關(guān)報(bào)道。于莉等曾描述了煙草莖點(diǎn)病的病原為P.tabaci，但該病原菌回接時(shí)僅能使煙桿發(fā)病，而葉片不產(chǎn)生任何癥狀[5]。該菌還能引起其他植物產(chǎn)生病害，如龜背竹莖點(diǎn)霉葉斑病[19]，說明廣生莖點(diǎn)霉沒有寄主特異性。除本研究中的廣生莖點(diǎn)霉外，莖點(diǎn)霉屬還有多個(gè)種可引起其他作物產(chǎn)生病害，如P.adianticola引起茶樹褐芽病[20]、苜蓿莖點(diǎn)霉(P.medicaginis)引起苜蓿莖點(diǎn)霉葉斑病[21]、莖點(diǎn)霉屬真菌能引起紫莖澤蘭褐斑病[22]、P.herbicola引起核桃莖點(diǎn)霉黑斑病[23]、向日葵莖點(diǎn)霉(P.macdonaldii)引起向日葵黑莖病菌[24]、南方莖點(diǎn)霉菌(P.jolyana)引起香蕉莖點(diǎn)霉鞘腐病[25]等。

前人報(bào)道煙草莖點(diǎn)病菌一般不直接侵染葉片， 且易從打頂抹杈和采葉傷口處侵入[26]。在測定病原菌致病性的試驗(yàn)中，筆者分別對與采集樣本同品種的K326伸根期及旺長期葉片和莖稈進(jìn)行回接。煙桿刺傷后較易發(fā)病，而煙葉無傷口也易發(fā)病，表明廣生莖點(diǎn)霉不僅能侵染煙草莖稈，也能侵染葉片，可侵染的煙株生長期也更廣范。在進(jìn)行煙田耕作時(shí)建議減少煙株機(jī)械損傷，以減少該病菌侵染煙株引發(fā)煙草莖點(diǎn)病。

本研究對煙草莖點(diǎn)病在貴州省2個(gè)地區(qū)的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，初步確定該病在貴州省2地確有發(fā)生。對病原菌進(jìn)行分離，并根據(jù)柯赫氏法則確定分離菌株為致病菌。進(jìn)一步對病原菌的rDNA-ITS序列及LSU基因進(jìn)行分析，并建立基于rDNA-ITS序列和LSU基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，最終將引起貴州省煙草莖點(diǎn)病的病原鑒定為半知菌亞門球殼孢目莖點(diǎn)霉屬廣生莖點(diǎn)霉，但關(guān)于該病菌是否能引起其他烤煙品種發(fā)病還須繼續(xù)探究。

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