桃葉衛矛花粉超低溫保存

李萬義， 孔 鑫， 韓亞潔， 宋 紅

(東北林業大學園林學院，黑龍江哈爾濱 150040)

桃葉衛矛(Euonymusbungeanus)，別稱白杜、絲綿木，是衛矛科衛矛屬的一種落葉小喬木，是我國常見的觀賞類庭園樹種之一。桃葉衛矛葉形秀麗，植株繁茂，包被有紅色假種皮的果實可長期宿存于枝頭，到了冬季，白雪紅果相映，十分美麗，在冬季可為季相色彩單調的北方園林增添了不少色彩。近年來，許多研究人員從多方面對桃葉衛矛進行了研究：溫陽等通過對8個鄉土樹種抗逆性的對比研究發現，桃葉衛矛在耐寒、抗旱、抗風等方面具有良好的適應性[1]；劉繼陽等通過對桃葉衛矛果實中主要活性成分的提取并對這些成分進行研究發現，桃葉衛矛果實總皂苷對人肝癌細胞系SMMC、人宮頸癌細胞系HeLa和乳腺癌細胞系MCF7有明顯的抑制生長作用[2]；宋紅等通過研究發現，桃葉衛矛種子粗脂肪中含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等脂肪酸[3]；還有研究發現，桃葉衛矛木材細膩堅韌，可用于雕刻、制作帆桿或滑車等，其種子可作藥用，用于治療膝關節痛、漆瘡等疾病[4]。由此可見，桃葉衛矛是一種集工業、藥用、觀賞應用于一身的植物，具有較高的推廣價值。隨著近年來各種極端氣候的出現以及人為因素對生態環境的破壞，如何對桃葉衛矛的種質資源進行妥善保存是今后的研究方向。若采用傳統的保存方法，如就地保存、遷地保存等， 極易使種質資源受到病菌或蟲害的影響，

進而給種質資源的保護造成極大障礙，因此，尋求一條經濟、高效、便捷的種質資源保存途徑迫在眉睫。

植物種質資源超低溫保存是指將植物細胞、組織或器官在液氮(-196 ℃)的超低溫條件下進行保存，在如此低的溫度下，植物材料中參與新陳代謝的各種生物酶的活性受到極大抑制，生物體新陳代謝基本停止，處于“假死”狀態，利用該方法可以實現植物種質資源的永久保存[5]。目前已經成功進行超低溫保存的材料類型有種子、休眠芽、莖尖分生組織、花粉、合子胚(胚軸)、體細胞胚、懸浮細胞、愈傷組織、原生質體等[6]。其中花粉超低溫保存操作簡單，可保持特定的基因型，解決雜交育種時的花期不遇或地理隔離等問題，也可有效解決每年采集花粉時擔心與其他品系花粉混合的問題。因此，本試驗將對桃葉衛矛的花粉進行超低溫保存，通過對花粉最適萌發培養基配比、培養條件、培養時間、超低溫保存最適含水量以及超低溫保存后的化凍方式進行探究，以期為今后桃葉衛矛種質資源保存及其新品種培育的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗地點設在適宜桃葉衛矛生長的黑龍江省哈爾濱市東北林業大學校園內。哈爾濱市的氣候屬中溫帶大陸性季風氣候，冬長夏短，全年平均降水量為569.1 mm，降水主要集中在6—9月份，夏季占全年降水量的60%，集中降雪期為每年11月至次年1月。四季分明，冬季1月平均氣溫約為 -19 ℃，夏季7月的平均氣溫約為23 ℃[7]。桃葉衛矛為聚傘花序腋生，每個花序有3～15朵花，花兩性，為黃綠色，花期為5月下旬至6月[8]。本試驗從2015年6月開始，選擇晴朗天氣，從生長發育良好的桃葉衛矛母樹上用鑷子采集新鮮花粉，采集完畢后裝入硫酸紙袋后拿回實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉生活力測定方法 花粉生活力是衡量花粉健康與否的重要指標，目前對于花粉生活力的表述有生活力(viability)、可染性(stainability)、花粉質量(pollen quality)、活力(vigour)、萌發力(germinability)、可育性(fertility)、受精力(fertilization ability)[9]。根據前人的研究進展以及預試驗結果分析，本試驗選用可染性和萌發力2項指標。可染性的測定采用氯化三苯基四氮唑(簡稱TTC)染色法，參照韓成剛等對芍藥花粉生活力的測定方法[10]，將一定量的0.5% TTC溶液注入1塊凹載片的凹穴中(液面不超過凹穴的最大深度)，用解剖針將花粉均勻地撒在溶液上面。將該凹載片放置在鋪有濕潤濾紙的培養皿內，然后將其放入25 ℃人工氣候箱中進行黑暗培養，6 h后取出凹載片，放在電子顯微鏡下觀察花粉染色情況，選取3個視野，統計被染色花粉占視野內全部花粉總數的比例。萌發力的測定采用懸滴萌發法[11]，首先將1滴花粉萌發培養液(少于200 μL)滴在方形蓋玻片上，然后將桃葉衛矛花粉用解剖針均勻地撒在培養液上，再將蓋玻片反轉放置在凹載片上，使花粉懸浮于培養液上，如圖1所示。將凹載片緩緩放入鋪有濕潤濾紙的培養皿內，防止由于轉移過程中產生的搖晃使得培養液與凹載片接觸。將培養皿放入 25 ℃ 人工氣候箱中培養一段時間后，將凹載片取出，放置在電子顯微鏡下觀察并統計萌發的花粉數。花粉管長度超過花粉直徑即為萌發花粉。每次隨機選取3個視野，統計視野內萌發花粉數占花粉總數的百分比，最后取平均值，作為該花粉的萌發率。

1.2.2 花粉萌發最適培養液的選擇 以桃葉衛矛花粉為材料，以去離子水作為溶劑，加入不同濃度的蔗糖、硼酸，采用2因素完全隨機的方法，共設計16種不同培養基(表1)。在培養液上均勻地撒播桃葉衛矛花粉，然后將其放置在25 ℃人工氣候箱中光照培養一段時間后觀察花粉萌發狀況，根據花粉的萌發率確定桃葉衛矛花粉萌發的最適培養液。

表1 因素水平設計

1.2.3 不同培養時間及培養環境對花粉萌發率的影響 以桃葉衛矛花粉為材料，將其均勻地撒播在篩選出的最適培養液上，然后分成2組，置于室溫條件下，1組放在光照下培養，另1組放于暗處培養，培養0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后，觀察并記錄花粉萌發狀況。

1.2.4 花粉日活力的變化 從桃葉衛矛開花的一天中選定不同的時段，即06：00、08：00、10：00、12：00、14：00、16：00、18：00，每隔2 h測1次花粉活力 (萌發率)，觀察一天中花粉活力的日變化。

1.2.5 超低溫保存后不同化凍方式對桃葉衛矛花粉萌發率的影響 將新鮮花粉裝入1.8 mL冷凍管中，花粉含量不超過冷凍管最大體積的2/3。投入液氮罐中至少保存1 h以上后取出，采用以下3種不同的化凍方式進行解凍：(1)室溫化凍30 min；(2)40 ℃水浴化凍2 min；(3)自來水化凍8 min。化凍完畢后對花粉的生活力進行測定，比較花粉的萌發率，選出最適化凍方式。

1.2.6 桃葉衛矛花粉超低溫保存 (1)不同含水量花粉的制備。首先采用烘干法測得桃葉衛矛花粉的最大含水量，具體方法如下：將稱量瓶放入烘箱中，將溫度調至105 ℃，烘至恒質量，稱量得數據ma，放入花粉再稱量，得數據mb(即樣品烘干前鮮質量)；然后放入烘箱內，在5～10 min內將溫度調至105 ℃，開始計時，于105 ℃ 2 h烘干后取出瓶蓋封口，放入干燥器，冷卻20～30 min，取出稱質量，然后再敞開瓶蓋，在105 ℃條件下烘烤40～60 min，反復2～3次，直到質量恒定，得數據mc，即樣品烘后干質量，以鮮質量為基數，根據如下公式計算花粉含水量：

(1)

在得到桃葉衛矛花粉最大含水量ω1后，利用硅膠干燥法進行花粉不同含水量梯度的配制。具體方法如下：稱取一定量的新鮮花粉ma，放入1.8 mL冷凍管中，然后稱取二者總質量mb，再然后將裝有花粉的冷凍管放入硅膠干燥器中，干燥一定時間后取出冷凍管，稱取其質量mc，根據公式(2)計算出該段時間損失的含水量ω2，最終測得干燥一定時間后的花粉含水量ω，以此類推進而得到不同含水量梯度的花粉。相關公式如下：

(2)

ω=ω1-ω2。

(3)

(2)根據上述方法將花粉調制成不同含水量梯度后，將其投入液氮罐中保存一段時間后取出，化凍后測定桃葉衛矛花粉的萌發率。

1.2.7 數據分析 采用SPSS 20.0和Excel軟件對所測數據進行統計分析，用Excel對所得數據進行統計畫圖。

2 結果與分析

2.1 桃葉衛矛花粉染色法的結果分析

經過TTC染色后，在顯微鏡下沒有觀察到被染成紅色的花粉粒，可見該方法不適合用于桃葉衛矛花粉活力的測定。這與楊秀蓮等研究桂花花粉活力時得出的研究結果一致[12]，因此本研究中桃葉衛矛花粉活力的測定選用離體懸滴萌發法。

2.2 桃葉衛矛花粉萌發最適培養液的選擇

從表2可以看出，桃葉衛矛花粉在不同配方的培養液中萌發情況有差異。花粉在蔗糖濃度為100 g/L時萌發率達到最高值。而隨著蔗糖濃度的進一步增加，花粉的萌發率又降低。對桃葉衛矛花粉在不同蔗糖和硼酸濃度培養基上的萌發率進行方差分析，由表3可以看出，花粉的萌發率在不同的蔗糖濃度間(F=78.428，P<0.01)、硼酸濃度×蔗糖濃度間(F=23.243，P<0.01)以及不同硼酸濃度間(F=10.047，P<0.01)差異都極顯著。從兩者貢獻的離差平方和來看，蔗糖對花粉萌發率的影響大于硼酸對花粉萌發率的影響，即蔗糖貢獻的離差平方和(630.190)大于硼酸貢獻的離差平方和(80.733)。結合桃葉衛矛花粉的萌發率，最終本研究篩選出桃葉衛矛花粉培養液中蔗糖濃度和硼酸濃度最適配比為 100 g/L 蔗糖+150 mg/L硼酸。

2.3 不同培養時間及培養環境對桃葉衛矛花粉萌發率的影響

從圖2可以看出，桃葉衛矛花粉在不同培養環境下的萌發率有明顯的差異，其中在光照條件下萌發率最高可達10.22%，而在黑暗條件下的最高萌發率為3.5%，因此對于桃葉衛矛花粉的培養應在光照條件下進行。進一步通過方差分析可知，F=21.273，對應的P<0.01，可以認為6個培養時間中至少有1個培養時間與其他培養時間之間存在顯著差異。利用多重比較(LSD)分析可知，光照條件下0.5、1.0、1.5、2.0 h與其他培養時間存在顯著差異，而2.0、2.5、3.0 h之間沒有顯著差異。由圖2可知，花粉前2.0 h的培養時間內，其萌發率有逐漸升高的趨勢，而在2.0 h后該趨勢進入較為平穩的階段，花粉萌發率不再有明顯的變化幅度。由此推測，桃葉衛矛花粉最佳的培養時間為2.0 h。在試驗中還發現，當培養時間過長時， 花粉的萌發數量不再增加，但花粉管的長度在不斷伸長，最終會影響試驗結束后對花粉萌發數量的統計，這與陳珊對亮葉蠟梅花粉進行活力測定時通過暗培養24 h后進行觀察統計的結果不一致[13]，推測引起該結果的原因為植物基因型的差異。

表2 不同蔗糖和硼酸濃度對桃葉衛矛花粉萌發率的影響

注：數值為每個處理3個重復的“平均值±標準差”。同列數據后不同小寫、大寫字母分別表示差異顯著、極顯著。

表3 不同蔗糖和硼酸濃度下桃葉衛矛花粉萌發率的方差分析結果

注：雙因素方差分析置信區間為95%。P<0.05表明顯著，P<0.01表明極顯著。

2.4 桃葉衛矛花粉日活力變化的結果分析

由圖3可知，桃葉衛矛的花粉萌發率(活力)在一天中的不同時段是不同的，其大致趨勢為06：00—12：00時段為下降趨勢，在12：00花粉活力降至最低值；而在12：00—16：00時段花粉活力呈上升趨勢，并在16：00達到最高值；在16：00—18：00時段，花粉活力逐步下降。通過方差分析可以看出，F=30.119，對應的P=0.00(<0.05)，可以認為在7個時刻中至少有1個時刻與另外1個時刻存在顯著差異。通過進一步多重比較分析可知，12：00與16：00與其他各時刻基本存在顯著差異。因此可知，桃葉衛矛花粉在一天中12：00時的活力最低，在16：00時的活力最高，這與李稚的研究結果一致[14]，可能是因為桃葉衛矛花粉在外界環境溫度較高時，花粉自身的酶活性降低，影響了其萌發力。

2.5 不同化凍方式對桃葉衛矛花粉萌發率的影響

本試驗采用3種化凍方式于桃葉衛矛花粉超低溫保存24 h后進行化凍試驗，比較3種化凍方式對花粉萌發率的影響，最終篩選出最佳化凍方式。由圖4可知，化凍方式對保存后的桃葉衛矛花粉萌發率有極顯著影響(F=613.430，P=0.00<0.01)，采用室溫化凍30 min后，桃葉衛矛的花粉萌發率可達14.34%，其效果優于40 ℃水浴化凍2 min和自來水化凍8 min這2種化凍方式。由此可以推測，室溫化凍 30 min 的化凍效果較好，可以將其運用于下一步的桃葉衛矛花粉超低溫保存試驗中。

2.6 不同含水量花粉超低溫保存前后的萌發率

脫水環節對花粉的超低溫保存是至關重要的，花粉含水量越高，低溫冷藏時細胞內越易形成冰晶，以致細胞膜受損，保存后的花粉死亡率就會越高，不能達到超低溫保存的目的。因此，探究花粉液氮保存前最適含水量對于花粉超低溫保存具有重要影響。由圖5可以看出，不同含水量的桃葉衛矛花粉在液氮保存前的萌發率沒有顯著差異，當花粉經過液氮保存后，出現了顯著差異。當桃葉衛矛花粉含水量為初始狀態(14.56%)時，液氮保存后的花粉全部死亡，推測是由于花粉內部含水量較高，在-196 ℃的超低溫環境中產生了冰晶，進而破壞花粉內部的細胞結構，導致花粉死亡。隨著花粉含水量的進一步降低，在4.14%～12.32%的含水量區間內，超低溫保存后的花粉萌發率呈現隨含水量降低逐步升高的趨勢。而當花粉含水量進一步從4.14%降低至1.67%時，超低溫保存后的花粉萌發率又開始降低，并最終全部死亡，可能是因為進一步的干燥對花粉細胞內的束縛水造成了破壞，最終使花粉死亡。這與張玉進等的研究結果[15]一致。

3 討論

園林植物種質資源的類型有很多，如種子、花粉、莖尖等，而評價這些種質資源好壞的關鍵因素就是其生活力指標。根據王欽麗等的研究結果可知，花粉生活力的測定方法目前可分為萌發測定和不萌發測定2種[9]。本研究選用了2種測定方法相結合，對桃葉衛矛花粉的生活力進行測定。試驗結果表明，經TTC染色法染色后的花粉沒有變紅的現象，而經離體萌發法測定后，桃葉衛矛花粉的花粉管有了明顯的伸長，由此可知TTC染色法不適合用來檢測桃葉衛矛花粉的生活力。

蔗糖和硼酸對于花粉萌發具有十分重要的作用。研究表明，蔗糖在花粉萌發過程中主要有2個方面的作用：一是保持了花粉細胞與外部培養液之間的滲透平衡，防止花粉及花粉管由于滲透失衡而出現破裂；二是可以給花粉的萌發以及花粉管的伸長提供能量。而硼酸在花粉萌發過程中的主要作用是促進花粉內部鈣離子的輸送，同時幫助花粉更大程度地吸收糖分，產生糖-硼酸復合體，對營養物質的運輸以及花粉萌發起到促進作用[16-18]。本試驗研究了蔗糖、硼酸雙因素作用下對花粉萌發的影響，結果表明，二者對花粉萌發率的影響都呈現出隨著濃度的不斷升高，桃葉衛矛花粉萌發率先升高后降低的規律。同時方差分析的結果表明，無論是蔗糖、硼酸的單因素作用，還是兩者共同作用，都對花粉的萌發起著顯著作用，說明桃葉衛矛花粉的萌發培養液需要蔗糖和硼酸。進一步比較可知，二者共同作用時，桃葉衛矛花粉的萌發率要優于二者的單因素作用。最終篩選出桃葉衛矛花粉萌發的最適培養液配方為100 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸。

花粉的萌發主要是由內因和外因共同決定的。內因是指花粉自身的基因型，而外因是指環境因素。本試驗中研究了桃葉衛矛花粉在不同培養時間以及不同培養環境中的萌發情況。結果顯示，桃葉衛矛花粉在光照環境下的萌發率要大于黑暗環境下的萌發率。而有的木本植物的花粉如亮葉蠟梅，需要在黑暗環境下進行培養，推測其原因是由花粉自身的基因型決定的。而對于花粉的培養時間，不同的植物材料其花粉的培養時間也不同，有些植物花粉的培養時間需要3 h，如魔芋、山茶[15，19]，而亮葉蠟梅的花粉培養時間需要長達 12 h[13]。本試驗結果表明，桃葉衛矛花粉的最佳培養時間為 2 h，當培養時間大于2 h后，花粉的萌發率將不再有較為明顯的變化。此外還發現，當培養時間過長時會導致花粉管過長，不利于后期統計萌發率。

趙劍穎等的研究表明：一天中萬壽菊的花粉活力呈先升高后降低的趨勢，在11：00—13：00之間花粉活力最高[20]。而在本研究中桃葉衛矛花粉在盛花期中的某天內的活力變化趨勢為先降低后升高，在12：00時花粉活力最低，而在16：00時花粉活力最高。這與李稚在研究桂花花粉日活力變化時的研究結果一致[14]，可能是由于夏季日最高氣溫集中在中午，過高的氣溫使得花粉內部的酶活性降至較低的水平，從而導致花粉萌發率降低。綜上所述，桃葉衛矛花粉最佳采集時期為一天中的16：00。

化凍方式是影響花粉超低溫保存效果的又一個重要的因素，如果采用了不適當的化凍方式，有可能在化凍過程中細胞內部產生次生冰，對花粉造成二次傷害，從而影響其花粉活力。目前主要的化凍方式大致可以分為35～40 ℃水浴化凍、自來水化凍、室溫化凍。因此在本試驗中對應研究了桃葉衛矛花粉超低溫保存后采用40 ℃水浴化凍2 min、自來水沖洗8 min、室溫化凍30 min 3種方式進行化凍。結果顯示，室溫化凍30 min是超低溫保存桃葉衛矛花粉的最佳化凍方式。目前較為廣泛的化凍方式為35～40 ℃水浴化凍，而該試驗結果與其他植物花粉超低溫保存化凍方式有所區別[13-15，19]，因此，對于選擇何種方式進行化凍應根據具體植物的花粉情況來決定。

新鮮的花粉含水量一般都比較高，過高的含水量在冷凍過程中形成冰晶，導致細胞膜受損，最終使花粉死亡。因此許多研究表明，適宜的花粉含水量是實現超低溫保存的關鍵[21-23]。然而由于花粉形態的特殊性和采集的難度，如果采用傳統的烘干法會消耗大量的花粉[24]，因此本試驗中采用室溫硅膠干燥法，先測出新鮮花粉的最大含水量，然后通過將花粉放入硅膠干燥器中干燥不同時間，產生一定的質量差，而這個質量差即花粉在該干燥時間內失去的水分質量，求出失去水分占原花粉質量的比例，再用最大含水量減去失去水分的比例，即可求得花粉的含水量，這樣既可以得到所需的花粉含水量，又可以避免烘干法測定花粉含水量時的高溫環境使花粉喪失活性。利用該方法制備得到不同含水量梯度的桃葉衛矛花粉后，將這些花粉進行超低溫保存并解凍，測定花粉萌發率顯示，桃葉衛矛花粉超低溫保存的最適含水量為4.14%。

桃葉衛矛屬兩性花，在本試驗中發現，桃葉衛矛的雄花容易受到外界惡劣氣候的影響，導致出現花期不遇、結實率低的問題，而通過花粉超低溫保存可以有效解決這樣的問題。此外，桃葉衛矛花粉超低溫保存還可以為其雜交育種提供優良的花粉，為進一步培育新品種提供了一條有效途徑。

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