綿羊MHC-DQB2 exon3單倍型的構(gòu)建及其與布魯氏菌病易感性相關(guān)性

嚴(yán) 國(guó)， 王元元， 羅 成， 齊江姣， 牟 云， 高劍峰

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003)

布魯氏菌病簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏桿菌引起的嚴(yán)重危害人民健康和農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的人畜共患傳染病，是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，羊?yàn)樵摬∽钪饕膫魅驹碵1]。調(diào)查顯示，2012—2014年新疆牛羊布病陽(yáng)性率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。因此，這一疾病對(duì)新疆這一畜牧業(yè)主產(chǎn)區(qū)所造成的損失也逐年增長(zhǎng)，遏制該疾病的傳播已成為亟待解決的重大問(wèn)題。

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是脊椎動(dòng)物的高度多態(tài)性基因群[3]。MHC蛋白的主要功能是抗原遞呈，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，與許多疾病的抗病性和易感性密切相關(guān)，MHC作為相關(guān)性研究的候選基因，受各研究領(lǐng)域的密切關(guān)注，已經(jīng)成為現(xiàn)代分子遺傳研究的焦點(diǎn)。綿羊的MHC位于20號(hào)染色體，MHCⅡ區(qū)與人的相似，區(qū)域內(nèi)的 DQ 和 DR 2個(gè)基因家族表現(xiàn)豐富的多態(tài)性[4]，而綿羊的多態(tài)性更集中在 DQ 家族[5-7]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是指由單個(gè)堿基的變化引起DNA序列發(fā)生改變的多態(tài)性，是基因組序列內(nèi)最為常見的變異形式。SNP作為第三代分子遺傳標(biāo)記，本身具有顯著特點(diǎn)，如數(shù)量多、分布廣泛、且穩(wěn)定遺傳等[8]。這些特點(diǎn)在疾病相關(guān)基因的研究中發(fā)揮著尤為重要的作用，尤其是那些位于基因編碼區(qū)的SNPs，可能會(huì)使基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量或質(zhì)量發(fā)生改變，使其與某種疾病的發(fā)生直接相關(guān)，因而備受各研究領(lǐng)域的關(guān)注[9]。由于單個(gè)SNP在復(fù)雜疾病中所起到的作用微小[10-11]，而由SNPs構(gòu)建的單倍型提供的遺傳信息卻比單個(gè)的SNP更多、更準(zhǔn)確、更符合多基因疾病的遺傳性，所以單倍型分析越來(lái)越成為復(fù)雜疾病關(guān)聯(lián)研究的有效工具，這為相關(guān)免疫性狀的關(guān)聯(lián)研究及抗病分子標(biāo)記輔助選擇奠定了一定的基礎(chǔ)。因此，本研究通過(guò) PCR-SSCP 技術(shù)結(jié)合測(cè)序的方法檢測(cè)哈薩克羊的MHC-DQB2 exon3的多態(tài)位點(diǎn)，探討SNPs與布魯氏菌病易感性相關(guān)性，此外構(gòu)建其單倍型，并初步推測(cè)與布魯氏菌病易感性相關(guān)的單倍型，為今后開展布魯氏菌抗性分子標(biāo)記輔助選擇研究提供了一定的依據(jù)，為進(jìn)一步定位具有易感性的遺傳位點(diǎn)而最終進(jìn)行抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本來(lái)源 本試驗(yàn)所用血液樣本部分(45支)來(lái)自于新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)站，全部為布魯氏菌病陽(yáng)性；部分(100支)采自新疆烏蘇市3個(gè)羊場(chǎng)，以頸靜脈采血法采血 5 mL 于肝素鈉抗凝管，4 ℃保存，以備基因組DNA提取。

1.1.2 主要試劑 布魯氏菌檢測(cè)試劑盒購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；Tris平衡酚購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；瓊脂糖為西班牙瓊脂糖(Biowest Agarose)；2×TaqPCR Master Mix 和 DL 2000 marker購(gòu)自北京天根公司；過(guò)硫酸銨購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED購(gòu)自美國(guó)Promega公司；親和硅烷、剝離硅烷購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 布魯氏菌陽(yáng)性檢測(cè) 采用虎紅平板檢測(cè)法對(duì)100只哈薩克綿羊進(jìn)行布魯氏菌檢測(cè)，在干凈載玻片上取30 μL被檢綿羊血清與等量的虎紅平板抗原混合均勻，在5 min內(nèi)以陽(yáng)性血清反應(yīng)為對(duì)照，觀察并記錄結(jié)果，被檢血清出現(xiàn)較為明顯的顆粒狀或絮狀凝集則判定為布魯氏菌陽(yáng)性，否則判定為陰性。以同樣的方法對(duì)所有樣品重復(fù)檢測(cè)2次，以確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

1.2.2 基因組DNA的提取與檢測(cè) 基因組DNA的提取：取2 mL無(wú)明顯血凝塊的新鮮血液，采用酚-氯仿法對(duì)其進(jìn)行基因組DNA提取。

DNA純度與濃度的檢測(cè)：采用生物光譜計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度，用Plate assay法和瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)DNA驗(yàn)證的濃度及純度進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)高濃度樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，于 -18 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 參照綿羊MHC-DQB2的基因序列(GenBank登錄號(hào)：EU176819)，利用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)該基因exon3的特異引物。引物序列為：F：5′-CCTCAGTGGAACCTACAGTGACC-3′；R：5′-TGCCC TTACTCCACTCCACCG-3′。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為：上下游引物各 0.75 μL，模板3.5 μL，無(wú)菌雙蒸水7 μL，2×TaqPCR Master Mix 8 μL，總體積20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸8 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.5 SSCP電泳 取3 μL的PCR產(chǎn)物與10 μL的變性上樣緩沖液(去離子甲酰胺9.5 mL；0.3%二甲苯青0.1 mL；0.5 mol/L EDTA 0.4 mL，pH值8.0)充分混勻，于PCR儀 98 ℃ 變性10 min，立即冰浴驟冷至少3 min，低溫恒溫循環(huán)系統(tǒng)溫度恒定至9 ℃，取10 μL變性產(chǎn)物上樣于10%的非變性聚丙酰胺凝膠(Acr ∶Bis=39 ∶1)，300 V預(yù)電泳15 min，而后3 W恒定功率過(guò)夜電泳10 h。次日電泳結(jié)束后，銀染顯色并在X光片觀片燈上分析帶型并拍照保存。

1.2.6 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 經(jīng)PCR -SSCP分析之后，選取不同基因型樣本，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳檢測(cè)后，送至北京六合華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNASTAR軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 利用Excel整理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用χ2適合性檢驗(yàn)法分別分析病例組與正常組哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg(HWE)平衡定律，P>0.001表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，符合Hardy-Weinberg平衡定律，反之P<0.001 則說(shuō)明不符合Hardy-Weinberg平衡定律。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，通過(guò)比較分析每個(gè)SNP的基因頻率或基因型頻率分別在病例組和正常組中的差異性，從而分析其與布魯氏菌病易感性的相關(guān)性。

1.2.8 單倍型構(gòu)建 去除等位基因頻率<0.05以及不符合Hardy-Weinberg平衡定律的SNPs位點(diǎn)，選擇同時(shí)符合以上2個(gè)條件的位點(diǎn)，用SHEsis在線軟件進(jìn)行單倍型的構(gòu)建，取連鎖不衡系數(shù)(D′值)作為連鎖不平衡指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 布魯氏菌檢測(cè)

采用虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)綿羊種布魯氏菌陽(yáng)性，結(jié)果在100個(gè)哈薩克羊個(gè)體中檢出布魯氏菌陰性個(gè)體84個(gè)，陽(yáng)性個(gè)體為16個(gè)，布魯氏菌陽(yáng)性檢出率為16%，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

2.2 基因組DNA的提取電泳檢測(cè)

哈薩克羊全血中提取的基因組DNA經(jīng)生物光譜計(jì)和Plate assay法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基因組DNA濃度在40～1 000 μg/mL。純度經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)整齊、清晰的單一條帶，符合后期試驗(yàn)要求。

2.3 MHC-DQB2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)

將哈薩克羊MHC-DQB2 exon3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與DL 2000 marker比較與預(yù)期的相符，因而判斷為目的片段。

2.4 SSCP分析

分別對(duì)病例、正常組哈薩克羊個(gè)體MHC-DQB2 exon3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP電泳，部分電泳結(jié)果見圖2。由于本試驗(yàn)應(yīng)用PCR-SSCP方法具有高度靈敏性，所以出現(xiàn)的基因型比較多，是否還有一些其他未檢測(cè)出的基因型，還有待于擴(kuò)大樣本數(shù)量以進(jìn)一步研究。

2.5 哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3 SNPs分析

通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)及測(cè)序的序列比對(duì)結(jié)果分析，哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3在282 bp內(nèi)共發(fā)現(xiàn)22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)無(wú)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明具有群體代表性。這些位點(diǎn)中不存在插入和缺失位點(diǎn)，有1個(gè)位點(diǎn)屬于四態(tài)性，1個(gè)位點(diǎn)屬于三態(tài)性，其余20個(gè)位點(diǎn)屬于二態(tài)性。這些二態(tài)性位點(diǎn)中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)有16個(gè)，包括8個(gè)A/G轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和8個(gè)C/T轉(zhuǎn)換位點(diǎn)；顛換位點(diǎn)有4個(gè)，包括A/T顛換位點(diǎn)2個(gè)，A/C、G/C顛換位點(diǎn)各1個(gè)。相比而言，轉(zhuǎn)換率為顛換率的4倍，這可能是因?yàn)镃pG(堿基C、G以及連接兩者的磷酸酯鍵 p)結(jié)構(gòu)上的胞嘧啶殘基是基因組中最易發(fā)生突變的位置，大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基形成堿基T，因此導(dǎo)致了C→T(互補(bǔ)鏈上G→C)的突變?cè)龆啵瑥亩鴮?dǎo)致了轉(zhuǎn)換位點(diǎn)遠(yuǎn)高于顛換位點(diǎn)[12]。

2.6 哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3的單氨基酸多態(tài)性(SAP)分析

對(duì)哈薩克羊DQB2 exon3氨基酸序列進(jìn)行分析，在93個(gè)氨基酸位點(diǎn)中，有20個(gè)屬于氨基酸多態(tài)位點(diǎn)，占總氨基酸位點(diǎn)數(shù)的21.5%。其中，有6個(gè)氨基酸突變?yōu)橛辛x突變，其余均為無(wú)義突變(表1)。

2.7 哈薩克羊MHC-DQB2 exon3多態(tài)性與布魯氏菌病易感性的關(guān)系

許多疾病的抗性和易感性都與MHC有關(guān)聯(lián)，作為針對(duì)某些疾病的抗性和易感性的候選基因的MHC，已經(jīng)成為現(xiàn)代分子免疫遺傳的研究熱點(diǎn)之一。本研究對(duì)MHC-DQB2基因的多態(tài)性與布魯氏菌病易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，MHC-DQB2可能是與布魯氏菌病易感性相關(guān)的基因之一。哈薩克羊MHC-DQB2 exon3 每個(gè)SNP的等位基因及基因型頻率在病例組和正常組中的分布差異見表2、表3，其中140 A/C/T/G位點(diǎn)、155T/C的等位基因在病例和正常樣本中的分布存在顯著差異(P<0.05)，初步分析認(rèn)為MHC-DQB2 exon3的140 A/C/T/G、155T/C與綿羊布魯氏菌病易感性相關(guān)，相關(guān)的研究?jī)?nèi)容目前尚未見報(bào)道。針對(duì)該基因每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)AA/Aa/aa基因型在病例和正常樣本中的分布無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3的SNPs位點(diǎn)及氨基酸變異位點(diǎn)

表2 中國(guó)美利奴羊MHC-DQB2基因exon3基因頻率

注：“*”表示病例組與正常對(duì)照組中國(guó)美利奴羊MHC-DQB2相同等位基因間差異顯著(P<0.05)。

2.8 病例和正常組MHC-DQB2 exon3的連鎖不平衡分析及單倍型的構(gòu)建

對(duì)符合Hardy-Weinberg平衡定律的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，通過(guò)SHSsis在線軟件[13]計(jì)算連鎖不平衡系數(shù)D′值，觀察各位點(diǎn)之間的連鎖不平衡程度，判斷是否存在連鎖不平衡。在MHC-DQB2 exon3的22個(gè)SNPs位點(diǎn)中，最終篩選出符合條件的18個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型的構(gòu)建，連鎖不平衡圖見圖3。方格內(nèi)數(shù)字就是連鎖不平衡系數(shù)D′值乘以100譬如99表示D′=0.99。D′值越大，意味著相關(guān)聯(lián)的2個(gè)SNPs間連鎖不平衡程度越強(qiáng)。通常認(rèn)為D′>0.9為高度連鎖，D′>0.7 認(rèn)為2個(gè)SNPs位點(diǎn)位于同一個(gè)Block區(qū)域，可以進(jìn)行單倍型分析。圖3中各個(gè)方塊的顏色由淺至深，表示連鎖程度由低到高。經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)整個(gè)MHC-DQB2 exon3存在7個(gè)LD Block(表4)，將其依次命名為Block1～Block7。

表3 中國(guó)美利奴羊MHC-DQB2基因exon3基因型頻率

注：基因型表示為AA/Aa/aa(其中A代表高頻率等位基因；a代表低頻率等位基因)； AH代表高頻率基因名稱；AL代表低頻率基因名稱。

由于一個(gè)群體中單倍型的頻率不能<0.03，因此單倍型頻率未達(dá)到0.03的未參與統(tǒng)計(jì)，對(duì)應(yīng)的單倍型組合也應(yīng)忽略，SHEsis在線軟件在單倍型分析過(guò)程中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)刪除不符合條件的單倍型組合，因而哈薩克羊MHC-DQB2 exon3最終分析了21種單倍型組合(表3、表4)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在病例組中Hap4、Hap6頻率都顯著低于正常組(P<0.05)，這表明這2個(gè)單倍型可能與布魯氏菌病抗性有關(guān)，或者說(shuō)具有這2個(gè)單倍型的個(gè)體對(duì)布魯氏菌病不易感，其中，Hap6頻率在病例和正常組中存在極顯著差異(P<0.01)；病例組Hap9頻率顯著高于正常組(P<0.05)，表明具有這一單倍型的個(gè)體可能更易感布魯氏菌病。綜合推測(cè)，這2種單倍型可能與布魯氏菌病易感性具有相關(guān)性。

表4 每個(gè)連鎖不平衡 block 中 SNPs 組成

3 討論

MHC ClassⅡ區(qū)段是一段具有高度多態(tài)性的基因，相對(duì)于人而言，綿羊的基因多態(tài)性在DQ區(qū)較之DR區(qū)更為豐富。因此，本研究選取了DQB2 exon3作為研究對(duì)象，通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合測(cè)序技術(shù)， 對(duì)哈薩克羊DQB2 exon3進(jìn)行了多態(tài)性分析，最終發(fā)現(xiàn)了22個(gè)SNPs位點(diǎn)，而其中只有2個(gè)位點(diǎn)在病例和正常組間存在顯著差異；在22個(gè)SNPs位點(diǎn)中只有6個(gè)位點(diǎn)為單氨基酸多態(tài)位點(diǎn)(SAPs)，其他位點(diǎn)均為無(wú)義突變，且都是由密碼子的簡(jiǎn)并性引起的。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究有義突變率較之其他研究成果[14-15]低，這可能是由exon3與exon2所編碼的氨基酸鏈在MHC蛋白上所處的位置及其所發(fā)揮的功能不同引起的，也有可能是因?yàn)榫d羊品種的不同造成的。MHC蛋白的主要功能是抗原遞呈，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用，與家畜的抗病性和易感性有著密切的關(guān)系。本研究通過(guò)對(duì)MHC-DQB2 exon3多態(tài)性與綿羊布魯氏菌病易感性相關(guān)性研究，初步篩選了與布魯氏菌病易感性相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，但由于MHC是一組緊密連鎖的基因群，在一條染色體上的等位基因很少發(fā)生同源染色體間的交換，構(gòu)成了一個(gè)單體型(單倍型)，在遺傳過(guò)程中MHC單體型是以一個(gè)完整的遺傳單位由親代傳給子代[16]。因此，本研究對(duì)符合要求的SNPs位點(diǎn)構(gòu)建了單倍型，得到了3種與布魯氏菌病易感性相關(guān)的單倍型，其中有2個(gè)單倍型在病例和正常組間達(dá)到了顯著差異水平(P<0.05)，1個(gè)達(dá)到了極顯著差異水平(P<0.01)。這為今后開展布魯氏菌抗性分子標(biāo)記輔助選擇研究提供了一定依據(jù)，為進(jìn)一步尋找具有易感性遺傳位點(diǎn)而最終進(jìn)行抗病育種奠定了基礎(chǔ)，但MHC-DQB2 exon3 的2個(gè)SNP位點(diǎn)及3個(gè)單倍型能否作為抗布魯氏菌病的遺傳標(biāo)記，還需要對(duì)這些哈薩克羊個(gè)體進(jìn)行攻毒試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證以及其如何參與綿羊布魯氏菌病的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。

表5 病例和正常組MHC-DQB2 exon3單倍型分析

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