梨萜類合成酶基因家族生物信息學與表達模式分析

趙榮榮 劉斌 郭超 劉恒 張元湖

（山東農業大學生命科學院 作物生物學國家重點實驗室，泰安 271018）

萜類化合物（Terpenoids）是指由異戊二烯（Isoprene，C5）為基本結構單元組成的一類天然化合物。萜類作為植物體內一類重要的次生代謝產物，由初生代謝途徑衍生而來，具有聚異戊二烯的碳骨架，根據異戊二烯的數目可以分為單萜（Monoterpene，C10）、倍半萜（Sesquiterpene，C15）、二萜（Diterpene，C20）、三萜（Triterpene，C30）和多萜。萜類化合物普遍存在于各種植物中，對植物的生長發育、防御等有重要的作用，同時也是梨和蘋果等花果實芳香物質的來源之一。植物中的萜類化合物根據其生理功能的不同可以分為初生代謝物和次生代謝物。初生代謝物對植物的生長發育必不可少，包括胡蘿卜素、類胡蘿卜素、甾體、多聚萜醇和植物激素等，次生代謝物的種類繁多，在植物與環境的相互作用、植物與昆蟲和動物之間的相互作用以及植物體之間的信號傳遞發揮重要的作用。一些萜類成分具有很高的藥用價值和醫療價值，如倍半萜成分青蒿素是目前治療瘧疾的最佳藥物［1］，紫杉醇是抗腫瘤的有效藥物等［2］。萜類化合物通過類異戊二烯途徑產生，研究表明，植物中類異戊二烯至少存在2條合成途徑，包括經典的甲羥戊酸途徑和丙酮酸/磷酸甘油醛途徑［3-5］。

萜類合成酶作為萜類合成途徑的關鍵酶是目前比較關注的研究方向之一，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［6］、水稻（Oryza sativa）［7］、番茄（Solanum lycopersicum）［8］、楊樹（populus trichocarpa）［9］、大冷杉（Abies grandis）［10］、葡萄（Vitis viniferaL.）［11］和蘋果（Malus domestica）［12］等植物中均有報導。梨基因組測序的完成和序列釋放為梨萜類合成途徑中各種關鍵酶的研究提供了可能［13］。Bohlmann等［14］在1998年根據萜類合成酶氨基酸序列的相關性把來自煙草、蕎麥等多個物種共33條萜類合成酶基因分為6個亞家族；Trapp等［15］在2001年根據基因結構把被子植物的萜類合成酶基因分為三類。

梨果實的內在品質主要決定于果實的香氣和風味，其中，果實香氣成分主要由其揮發性的產物組成，而萜類化合物是其揮發性產物的重要組成部分。在高等植物中，TPS基因均以基因家族的形式存在。梨作為一種重要的經濟作物，在基因組水平對其TPS基因家族的研究成果還非常匱乏。本研究通過整合梨CDS、全基因組數據和蛋白組數據等，結合生物信息學和分子生物學方法，對梨萜類合成酶基因家族進行各種分析，包括梨萜類合成酶基因家族成員的鑒定，理化性質和二、三級結構的預測，保守基序分析和組織表達模式分析等，旨在為梨TPS基因家族成員各基因的具體生物學功能和改良梨果實品質的后續研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

梨（Pyrus bretschneideri）全基因組數據下載于http://gigadb.org/dataset/100083。TPS蛋 白 質 序列來源于NCBI蛋白質數據庫（GenBank），蘋果（Malus domestica）AAO22848.2；擬南芥（Arabidopsis thaliana）AAO85539.1，AAG09310.1，AAO85533.1；大 冷 杉（Abies grandis）AAB70907.1；玉 米（Zea mays）AAA73960.1； 南 瓜（Cucurbita maxima）AAD04292.1，AAB39482.1；金 魚 草（Antirrhinum majus）AAO42614.1；番 茄（Solanum lycopersicum）AAC39431.1；黃瓜（Cucumis sativus）BAB19275.1。供試材料品種為西洋梨，取自于山東農業大學果樹實驗基地。取3年生野生西洋梨新生幼葉、幼芽、根和莖，用錫箔紙包好，液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 梨TPS基因家族成員的鑒定 從梨（Pyrus bretschneideri）全基因組數據庫（http://gigadb.org/dataset/100083）下載基因組和蛋白組數據，構建本地BLAST數據庫［16］，以GenBank中已注冊的50條TPS蛋白序列作為查詢序列執行本地BLASTP搜索，搜索的e值設置為（e-10）。搜索出的萜類合成酶同源序列使用保守域預測軟件Pfam和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線工具檢測候選蛋白質序列［17］，使用Pfam數據庫的序列號PF01397（萜類合成酶N末端結構域）和PF03936（金屬離子結合結構域）鑒定梨TPS基因。

1.2.2 梨TPS基因家族的蛋白理化性質和亞細胞定位分析 使用ExPASy在線工具（http://www.expasy.org/proteomics）對鑒定出的所有蛋白序列進行氨基酸數目、分子量、等電點以及開放閱讀框等的預測。使用SOPMA（http://www.expasy. org/proteomics）進行TPS蛋白二級結構預測。通過WOLF PSORT（http://www.genscript.com/ wolf-psort.html）和Targetp1.1共同進行TPS基因的亞細胞定位分析。

1.2.3 梨TPS基因家族系統進化樹的構建 使用Clustal X方法對梨TPS氨基酸序列進行多重序列比對，使用MEGA6.0軟件進行鄰接法系統進化樹的構建，校驗參數Bootstrap重復1 000次，對獲得的進化樹進行亞族分類和進化分析［18］。

1.2.4 TPS蛋白保守域和三級結構預測 使用在線軟件 MEME（http://meme-suite.org/tools/meme） 對TPS蛋白保守域進行分析［19］。根據已知的梨TPS蛋白完整序列，通過在線工具SWISS-MODEL進行同源建模獲得梨TPS蛋白的三級結構模型［20，21］。

1.2.5 TPS基因家族成員的基因結構和染色體定位分析 根據從梨全基因組數據庫下載得到的外顯子、內含子和梨基因組定位信息從基因庫中提取待分析的蛋白相關信息，按GSDS所需格式整理，提交至GSDS在線網站進行基因結構分析。在梨基因組數據庫中檢索每一條TPS基因在染色體上的起始位置、終止位置和每一條蛋白在染色體上的位置信息。

1.2.6 梨TPS基因的組織表達分析 使用TIANGEN公司產品RNAprep Pure Plant Kit提取西洋梨根、莖、新生幼葉、幼芽總RNA。使用反轉錄試劑盒FastQuant RT Kit（With gDNase） 合 成 cDNA。 設計實時熒光定量PCR引物（表1）。采用梨ACTIN（AF386514）作為內參基因。方法按照CWBIO公司UltraSYBR Mixture（Low ROX）說明書進行。反應體系為 2×UltraSYBR Mixture（Low ROX）9 μL、引物 1（10 μmol/L）0.5 μL、引 物 2（10 μmol/L）0.5 μL、cDNA 1 μL 和 ddH2O 9 μL。反應條件為 95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環，溶解曲線的溫度是65℃-95℃。

表1 引物序列

2 結果

2.1 梨TPS基因家族的鑒定和理化性質分析

以GenBank中已經注冊的50條TPS基因作為查詢序列初步篩選得到49個候選蛋白序列。使用Pfam和SMART確定保守結構域，刪除不含有典型結構域PF01397（萜類合成酶N末端結構域）、PF03936（金屬離子結合結構域）的蛋白序列，最終得到33個TPS基因家族成員，少于擬南芥（40個）和番茄（44個）。參考擬南芥中TPS的命名方式，將梨TPS分別命名為PbrTPS1-PbrTPS33。利用ExPASy提供的在線工具對各條基因的基本信息進行預測，包括分子量、等電點、基因位置和CDS長度等（表2），結果表明，梨TPS的CDS長度范圍為645-2 451，ORF長度范圍為1 159-23 665。通過分析發現，鑒定得到33條梨TPS基因家族成員的等電點均小于7，推測大多數的梨TPS基因可能編碼弱酸性蛋白，在酸性的亞細胞環境中發揮作用。

染色體定位結果表明，33個TPS基因家族成員分別定位在梨的8條染色體上。分析發現，定位到第12染色體上的TPS基因序列數量最多。各有一條分別定位在第8、第10和第17染色體。其中，PbrTPS3、PbrTPS5、PbrTPS6、PbrTPS7、PbrTPS30和PbrTPS31定位在scaffold上（表2）。

2.2 TPS基因家族成員二級結構和亞細胞定位分析

Protscale預測結果表明33條TPS基因家族成員均屬于親水性蛋白。使用SOPAM程序（http://www.expasy.org/proteomics）對33條蛋白序列進行二級結構預測，結果（表3）表明，梨TPS蛋白序列均由α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈等二級結構元件組成。除PbrTPS24、PbrTPS25、PbrTPS27和PbrTPS30以 無規卷曲為主要二級結構存在外，另外29條蛋白序列的二級結構主要形式均以α-螺旋形式出現。

使用WOLF PSORT和Targetp1.1工具共同進行亞細胞定位預測，結果（表3）表明，33條TPS蛋白大部分定位于細胞質，但是也有少數分別定位于內質網、葉綠體、細胞核等部位。

2.3 梨TPS基因家族成員系統進化和基因結構分析

2.3.1 梨TPS蛋白系統進化分析 為了進一步了解梨TPS基因家族成員的系統進化關系，使用軟件MAGA6.0采用鄰接法對已經發現的33條梨TPS蛋白序列構建系統進化樹進行進化聚類和分析，參照Bohlmann等［14］對TPS基因家族的分類方法對梨TPS基因家族進行亞家族分類，發現33個梨TPS蛋白可以分為5個亞族（圖1）。同時使用這33條序列與NCBI已經注冊的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、蘋果（Malus domestica）、番茄（Solanum lycopersicum） 等 植 物 中 的 TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-g和TPS-e/f亞家族各成員共同構建系統進化樹，發現僅有33條序列進行分類的結果相同（圖2）。因此確認各亞家族含有的TPS基因家族成員的數量各不相同。其中TPS-a亞家族包含的成員數量最多，與葡萄［22］和中粒咖啡［23］等植物研究過程中發現的規律相似。

表2 梨TPS基因家族成員信息

2.3.2 梨TPS基因家族基因結構分析 使用GSDS網站對基因結構進行預測。結果（圖3）表明，基因結構特征和亞家族之間具有對應關系，同一亞家族成員基因結構之間非常相似，內含子數量3-15個，但多數含有4-7個。

進一步分析發現，TPS-a亞族的外顯子數量均比較多而且密集，除Pbr024828.1之外，TPS-a亞族和TPS-b亞族包含4-7個外顯子，而TPS-c亞族和TPS-g亞族的內含子外顯子組成則比較分散，但是各亞族內的組成結構都比較相似，因此，推測各組內的基因家族成員間在進化關系上也較近。

表3 梨TPS蛋白家族二級結構和亞細胞定位

2.4 梨TPS基因家族成員的保守基序分析

圖1 梨TPS基因家族系統進化樹

為了進一步分析梨TPS蛋白序列在各個亞族上的差異，使用MEME在線軟件對TPS基因家族的保守結構域進行預測，最終獲得20個保守基序（圖4）。分析發現，TPS-a亞族蛋白大多含有較多的基序數目，在TPS-a亞族中多數第一個保守序列是Motif12，其對應的序列為DTFDVHRPKPSATFSP SIWGDHFJSYASLZVDAELEQHVQE，而以Motif20為結束的保守基序對應的序列是KDLIASTLVEPVPL。另外，TPS-a中保守基序個數相對較多，而TPS-e/f的Motif個數相對較少。除PbrTPS5外，其余TPS基因家族成員中均含有Motif1和Motif3這兩個保守基序，因此，這2個位點所包含的序列DLYDLYTVALRFRLLRQHGYNVS和YYFWSLGVY FEPQYSFARKILTKVTAJVTIIDDIYD在梨TPS蛋白中是高度保守的。Motif1、Motif7、Motif12構成了靠近N端的TPS保守結構域序列，Motif2、Motif10、Motif20構成了靠近C端的保守基序。

圖2 梨與其他植物TPS蛋白的系統進化樹

對發現的20個保守基序進行Pfam和SMART注釋分析后共對4個基序進行了命名，分別是基序2、基序3、基序6和基序7（圖5），SMART驗證結果顯示基序7是萜類合成酶N末端結構域PF01397所包含的基序，基序2、3、6是金屬離子結合結構域PF03936所包含的基序，剩余的Motif保守基序是未知的功能元件。

2.5 梨TPS基因家族成員的三級結構分析

圖3 梨TPS基因家族基因結構分析

圖4 梨TPS基因家族保守基序分析

圖5 梨TPS氨基酸序列Logo圖譜

蛋白質的生物學功能很大程度上取決于蛋白的空間結構，因此蛋白結構分析對于其功能的研究具有重要意義。使用在線工具SWISS-MODEL對梨TPS蛋白的三級結構進行同源建模。在對33個梨TPS蛋白進行同源建模后，發現TPS-a、TPS-c、TPS-g和TPS-e/f亞家族內的蛋白質在空間結構上都高度相似，各亞族內蛋白質具有高度保守的結構特征，因此分別在上述4個TPS亞家族中各選擇2個作為代表性的序列進行同源建模（圖6），對TPS-b亞家族所有成員進行三級結構分析后發現得到的三維結構具有差異（圖6），推測TPS-a、TPS-c、TPS-g和TPS-e/f亞家族內蛋白質具有相似的功能而TPS-b亞家族成員在發揮的功能上可能有所差異。

圖6 梨TPS蛋白三級結構

2.6 梨TPS基因表達分析

基于梨TPS基因的序列相似性和三級結構分析結果，對上述已經進行三級結構分析的10條序列進行組織表達模式分析。結果（圖7-A）顯示，除PbrTPS24外，其余9個PbrTPS在根、莖、幼葉和幼芽中均有表達，且呈現出多種相對表達模式。另外，PbrTPS11、PbrTPS15、PbrTPS27、PbrTPS30和PbrTPS31在莖中的表達量最高，PbrTPS26、PbrTPS28和PbrTPS29在根中的表達量最高，PbrTPS23和PbrTPS24在葉中高表達（圖7-B）。

圖7 PbrTPS在梨不同組織中的表達分析

3 討論

萜類合成酶是萜類化合物合成途徑中的關鍵酶。近年來，不同物種基因組測序相繼完成，使得從基因組的角度分析和研究基因家族成為可能［22-24］。目前，多個物種中的TPS基因家族成員已經被鑒定出來，在模式植物擬南芥［6］中發現了40個TPS基因家族成員，在番茄［8］中發現了44個TPS基因家族成員。在對擬南芥全基因組分析得到的40個TPS分析后發現，其中30個基因在序列相關性、基因結構和系統發育上非常相似，推測可能是由于在其進化過程中序列上發生了改變，出現了基因的片段重復或者串聯重復等，進而導致不同酶結構和功能的不同［6］。本研究對梨與其它植物TPS蛋白的系統進化樹研究，同樣發現大多數處于同一個亞族的TPS基因不僅在進化上關系較近，同源建模結果顯示蛋白質三維結構也非常相似，推測其編碼的蛋白質功能也非常相似。二級結構預測結果顯示，梨TPS蛋白二級結構序列均由α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈等形式組成，α-螺旋和無規卷曲是其主要組成元件，這與在蘋果［12］等植物中不同二級結構元件的比例和分布規律相似，推測不同來源的植物中TPS基因可能發揮相似的功能。Yoshikuni等［25］研究表明，功能專一性的酶是由功能復雜的酶進化而來，少量氨基酸之間的替換可以促進酶功能上的進化，因此，在同一個物種中通過基因進化出現多種不同萜類合成酶很有可能促進萜類代謝下游產物種類的增多。研究表明，TPS基因家族不僅廣泛的存在于各種植物中，在不同植物基因組中其基因家族成員的數目差異也較大。對多種已經完成測序的植物中的TPS基因家族成員進行分類分析后發現，除大豆外，其他雙子葉植物和單子葉植物的TPS基因家族中TPS-a亞家族成員數目最多［26，27］，在本實驗中發現共有20個TPS基因屬于TPS-a亞家族，占梨中TPS基因的大多數，因此推測在梨中，倍半萜類化合物種類和數量最為豐富，而在本研究中并沒有發現TPS-d基因家族的成員，研究表明TPS-d基因家族是裸子植物特有的相對獨立的基因家族分支［23］，而梨樹屬于被子植物，這可能是在梨基因組中沒有鑒定到TPS-d亞家族成員的主要原因。

目前，TPS基因家族的研究主要集中于蘋果、擬南芥和番茄等植物中，而關于梨TPS基因家族的研究尚未見到報導。本研究根據梨與擬南芥中TPS基因的同源性進行了命名，所獲得的TPS基因數目低于蘋果中已經發現的TPS基因數目，推測可能是由于梨的全基因組學研究的不完全性導致，但仍有可能在梨中其自身的TPS基因家族成員數目相對較少。使用MEME在線工具進行保守基序預測，最終對4個基序進行命名。另外，梨TPS基因在染色體上呈隨機不均勻分布，這也與TPS基因在其他物種染色體上的分布規律相似，如蒺藜苜蓿的23條TPS基因在第1、4、8染色體上均沒有分布［28］。目前研究結果表明能夠正常發揮功能的萜類合成酶基因長度一般最少在300 bp以上，如紅豆杉中的紫杉二烯合成酶基因編碼303個氨基酸［29］，而在本研究發現PbrTPS10僅由214個氨基酸編碼，推測可能是由于基因組進化過程中發生了片段缺失現象，但是其是否能夠發揮萜類合成酶的正常功能，還需要后續的實驗進一步驗證。在對不同基因家族成員的組織表達模式進行分析發現，萜類合成酶基因的表達存在組織特異性，例如PbrTPS30在莖中的表達量比幼葉和幼芽中高9倍左右，PbrTPS24在根中基本不表達，這可能是由于萜類化合物存在物種和組織特異性，因此萜類合成酶基因的表達也存在組織特異性。

萜類合成酶是合成萜類代謝終產物的關鍵酶，是萜類化合物合成過程中的直接催化者，因此萜類合成酶催化的反應步驟是植物萜類代謝途徑中的靶位點。由于植物體內大部分與萜類合成相關的酶表達量較低，相應的萜類化合物產量較低很難提取和純化，因此需要在深入的了解萜類代謝途徑的同時，更多的鑒定和分離出萜類合成過程中的各種關鍵酶，進而通過基因工程技術提高目的萜類化合物的生物合成水平。梨樹是重要的經濟作物，同時也具有重要的生態價值和觀賞價值。梨果實中的芳香物質是評價果實內在品質的重要指標之一。近年來研究表明，果實中的揮發性物質主要包括醇類、醛類和脂類等，目前對西洋梨的研究大多集中于果實采摘后生理特性和貯藏技術的研究，而對其香氣成分的研究相對較少。萜類合成酶與果實中各種揮發性萜類物質的種類和含量密切相關，因此，研究梨TPS基因家族各成員對提高果實品質也具有重要意義。

4 結論

基于梨基因組數據庫共鑒定獲得33個梨萜類合成酶基因，定位于梨的8條染色體上，聚類為5個亞家族，其中，TPS-a亞家族成員數量最多，包括20個TPS基因，并且未發現TPS-d基因家族成員，各亞家族TPS蛋白三級結構高度相似。TPS基因家族成員存在組織特異性表達。

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