嗜水氣單胞菌bamA、bamB、bamD突變株的構建及其對外膜蛋白轉運的影響

黃放 林向民

（1. 福建農林大學生命科學學院，福州 350002；2. 福建農林大學福建省農業生態過程與安全監控重點實驗室，福州 350002）

細菌的外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）是一類位于革蘭氏陰性細菌外膜上的蛋白質，可協助細菌攝取所需的營養物，促進細菌的生長，并在細菌的生理與病理機制中扮演著重要作用［1-4］。外膜蛋白的合成、轉運與正確折疊需要經歷一個復雜的過程，先在細胞質內合成具有N-末端信號的前體，經由SEC系統介導穿過細胞內膜，并在分子伴侶（Skp，SurA）的作用下經過周質空間，最終在BAM（β-barrel assembly machinery）復合物的協助下正確地折疊并整合到外膜中形成β-桶狀結構［5-7］。BAM復合物一般由一個外膜蛋白BamA和4個脂蛋白 BamB、BamC、BamD 與 BamE組 成［8-10］。 前 期研究發現大腸桿菌的BamA屬于Omp85家族蛋白，它與BamD是BAM系統中必不可少的組成部分，在外膜蛋白轉運中起著至關重要的作用［7，11］。BamB、BamC、BamD的同源物僅存在于革蘭氏陰性菌，單獨突變bamB、bamC和bamE基因，可引起少數外膜蛋白的錯誤裝配。而三個重要性相對較弱的脂蛋白BamB、C、E對外膜蛋白轉運的影響也各不相同，bamB的缺失對外膜蛋白的合成產生較大的影響［11-14］。此外，大腸桿菌BamA∶B∶C∶D∶E形成核心復合物，并在表面活性劑的作用下，可以分解為BamA∶B、BamC∶D和BamC∶D∶E三種復合物形式，而bamC的缺失會導致這些復合物的穩定性下降，并導致BamB與BamD對蛋白酶的敏感性增加［16］。同時在野生株中BamA易受外源的蛋白酶K的影響，bamE的缺失在一定程度可以降低其影響［17］。但在不同細菌中，BAM系統的復合物組成及其功能也存在一定差異。

目前對于BAM系統的研究大都集中于大腸桿菌及腦膜炎雙球菌等少數幾種細菌中，在其他細菌中的相關研究還鮮有報道。嗜水氣單胞菌ATCC 7966是一株屬于O∶1血清型且具有一定毒性的模式菌株［18］，BAM系統在該菌株中如何發揮調控作用尚不明確。本研究利用同源重組交換的方法成功構建嗜水氣單胞菌bamA、bamB和bamD突變株，并結合質譜及Western blotting技術，研究這3個重要的蛋白對多個外膜蛋白表達及轉運的影響，從而深化對BAM復合物在嗜水氣單胞菌外膜轉運系統中作用的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒、引物 嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrohilaATCC 7966由實驗室保存，感受態細胞E.coliS17-1λpir與自殺載體pUTKm1均由福建農林大學張燎原老師惠贈。根據Uniprot數據庫中bamA、bamB、bamD的基因序列設計相應引物（表1）。

表1 嗜水氣單胞菌ATCC7966 bamA、bamB、bamD基因突變株構建的引物

1.1.2 生化試劑 限制性內切酶KpnI、SacI、ScaI和T4 DNA連接酶購自賽默飛世科技有限公司；DNA聚合酶和DNA marker為TaKaRa公司產品；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Omega公司；基因組小量制備試劑盒購自天根生物科技公司；瓊脂糖購自生工生物工程有限公司；卡那霉素（Kan）氨芐青霉素（Amp）均購自生工生物工程有限公司。

1.1.3 培養基 胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 以提取的嗜水氣單胞菌ATCC 7966基因組DNA 為模板，利用相關引物進行 PCR擴增反應，PCR 產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測后將獲得的特異性DNA條帶用膠回收試劑盒回收。

1.2.2 基因突變株的構建 根據BamA、B、D基因序列分別設計引物（引物序列詳見表1），以嗜水氣單胞菌為模板，PCR擴增片段，擴增后的片段進行雙酶切（SacI、ScaI），經再次回收后與酶切后的自殺載體pUTKm1連接。連接產物轉化至E.coliS17-1λpir，從而完成同源重組載體的構建。雙親本雜交參考張燎原方法進行操作［18］。

雙親本雜交利用的原理為同源重組單交換，目的是將同源重組載體整合進入嗜水氣單胞菌的基因組中，具體操作如下：分別過夜培養嗜水氣單胞菌 ATCC 7966 和E.coliS17-1λpir/pUT-bamA、bamB、bamD，以1∶20（V/V）的接種量轉接至新鮮LB液體培養基進行培養，OD600nm至0.8（約3 h），取100 μL 嗜水氣單胞菌培養液和 400 μLE.coliS17-1λpir/pUT-bamA、bamB、bamD培養液至離心管中進行混合，在4℃條件下進行離心（4 000 r/min），加入100 μL新鮮LB液體培養基重懸浮菌體，取50 μL重懸浮菌液點至預先準備好的放有0.22 μm膜的平板上，正置培養12 h后，用1 mL LB液體培養基將膜上培養的菌體洗滌下來，取100 μL洗滌下的菌液涂布在含終濃度100 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上進行篩選，長出的菌落經特異性引物進行PCR驗證。

1.2.3 膜蛋白的提取 分別挑取嗜水氣單胞菌ATCC 7966野生株與突變株的單克隆菌落于5 mL的LB培養基，30℃震蕩過夜培養，以1∶100（V/V）轉接到100 mL LB液體培養基中擴大培養，30℃培養至OD600nm為1.0，8 000 ×g離心10 min收集菌體，超聲破碎菌體，離心收集上清。將所得上清經0.45 μm濾膜過濾，濾液于超速離心機中以29 300 r/min離心60 min，沉淀用適量的PBS緩沖液溶解，-20℃保存。

1.2.4 差異蛋白的SDS-PAGE分析與質譜鑒定 取經超速離心法得到野生株與突變株的膜蛋白進行SDS-PAGE分析，分析條件為恒壓90 V，分離膠濃度為10%，上樣量為20 μL電泳至溴酚藍行至電泳槽下端為止，電泳后用考馬斯亮藍R250染色。將蛋白膠上所選擇的差異條帶切下，先用100 μL Milli-Q水震蕩洗滌兩次，再加入脫色液（50 mmol/L碳酸氫銨/乙腈=1∶1）至膠粒藍色褪去；加入150 μL純乙腈脫水至膠粒完全變白，真空干燥；加入100 μL的10 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），56℃水浴60 min；冷卻到室溫后，吸干，快速加入100 μL的55 mmol/L碘乙酰胺（IAA），置于暗室45 min；后依次用25 mmol/L碳酸氫銨、50%乙腈和100%乙腈，脫水到膠粒完全變白為止，真空抽干；后用Trypsin酶液消化過夜，加入2%三氟乙酸（TFA）終止反應，使TFA終濃度為0.1%，振蕩混勻，離心，酶解的肽段用LC-LTQ XL質譜儀鑒定蛋白。

1.2.5 突變株bamA、B、D的Western blot分析 將敲除菌中提取的膜蛋白，經SDS-PAGE電泳分離，進行印記雜交，將凝膠、濾紙、PVDF膜置于盛有轉膜緩沖液的容器中，浸泡5 min，恒流1.3 mA，轉膜30 min，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉60 min，加入相應外膜蛋白抗體（1∶2 000稀釋）4℃孵育過夜，洗滌。后加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體，室溫孵育60 min，洗滌，顯色。

2 結果

2.1 bamA（AHA_1181）、bamB（AHA_1762）、bamD（AHA_4074）基因片段的擴增

如圖1所示，利用DNA聚合酶從嗜水氣單胞菌ATCC 7966基因組DNA中PCR擴增約1 060 bp、750 bp、580 bp的目的基因片段。對照Marker可以看出 PCR擴增出bamA（1 060 bp）、bamB（750 bp）、bamD（580 bp）的特異性條帶，確定PCR擴增出的條帶為所需的基因片段。

圖1 bamA、bamB、bamD基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.2 自殺載體pUTKm-bamA、bamB、bamD的構建

PCR產物經限制性內切酶完全消化后，與載體酶切后回收的片段連接，轉化感受態細胞E. coliS17-1λpir，在50 μg/mL卡那霉素 LB 平板上挑選克隆。通過酶切（圖2）和測序鑒定，獲得正確重組子自殺載體pUTKm-bamA-D，再通過雙親本接合轉移，在100 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL卡那霉素抗性LB平板上篩選，得到接合轉移子。

圖2 pUT-bamA-D雙酶切電泳圖

2.3 bamA、B、D突變體的PCR驗證

經過抗性平板的初步篩選，篩選到bamA、bamB、bamD突變菌株。為了進一步確定bamA、B、D基因是否已經被插入突變，分別在BamA、B、D的上游設計一條引物（PbamA1、PbamB1、PbamD1），在自殺載體上設計一條引物（P4）。以野生株和突變株的嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。結果（圖3）發現可以分別擴增出特定長度的片斷，而對照為陰性圖3。同時將擴增產物送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序，測序結果顯示正確。綜上結果證實pUT-bamA、pUT-bamB、pUT-bamD載體已經插入嗜水氣單胞菌ATCC 7966基因組中。

圖3 突變株bamA、B、D的PCR驗證

2.4 突變株差異蛋白的質譜分析結果

同野生株嗜水氣單胞菌外膜蛋白進行比較，突變菌株bamA、bamB、bamD存在差異表達蛋白（圖4），對這些差異蛋白進行質譜分析，共鑒定到7個差異蛋白，其中5個為外膜蛋白，2個為位于內膜上的蛋白酶（表2）。

圖4 嗜水氣單胞菌野生株與突變株膜蛋白的SDS-PAGE圖譜

2.5 bamA、B、D突變后對相關蛋白表達和轉運的影響

為了研究bamA、B、D突變后的變化，選取實驗室已有的 Ferrichome receptor（A0KQZ1）、Maltoporin（A0KHF6）、Colicin I receptor（A0KQ46）、TonB-dependent copper receptor（A0KFG8） 外膜蛋白抗體，研究突變菌株bamA、B、D在胞漿和膜蛋白水平上，對蛋白的表達與轉運的影響。結果發現，與野生株嗜水氣單胞菌相比較，bamA、bamD突變后所有的相關蛋白都處于下調的狀態，特別對 Colicin I receptor與 Maltoporin、TonB-dependent copper receptor三種外膜蛋白的影響最大。通過對細菌胞漿組分的western blotting結果分析，發現所有的檢測蛋白也都下調，而且基因的缺失對Ferrichome receptor與 Colicin I receptor、TonB-dependent copper receptor的表達影響較大，對Maltoporin的表達影響較小。但不同突變株對不同外膜蛋白的影響有差別，例如Colicin I receptor在bamD突變菌中胞漿中的表達明顯降低，而Maltoporin則在bamB突變菌中顯著下調（圖5）。

表2 LC-MS鑒定SDS-PAGE分離嗜水氣單胞菌與突變株bamA、bamB、bamD外膜蛋白組的差異蛋白

圖5 野生株（CK）與bamA、bamB、bamD突變株在膜蛋白水平與胞漿蛋白水平上多個相關蛋白的Western blotting

3 討論

細菌的外膜蛋白位于細胞與外界環境的交界處，在信號傳導、毒力侵染、細菌耐藥、抗逆性等多個生物學功能中起重要作用。因此，BAM系統復合物的正常運轉可確保外膜蛋白的正確折疊和轉運，對維持細菌的正常生長至關重要。Charlson等［13-14，19］在大腸桿菌中發現BamA 和BamD是細菌外膜蛋白折疊和轉運的必須蛋白，bamB基因的突變，可以使BAM復合物受到損傷，部分外膜蛋白的分泌減少；而Fardini 等［12］則認為沙門氏菌中的BamB并不是一個重要蛋白，當敲除bamB基因后，僅對BAM復合物系統造成輕微損傷。此外，研究發現腦膜炎雙球菌中bamC和bamE的突變，對BAM復合物系統影響并不大，并不是細菌生存所需的關鍵蛋白［20］。

鑒于以往未見嗜水氣單胞菌中BAM系統對外膜蛋白轉運影響的報道，本研究利用分子生物學方法敲除該菌BAM系統中的重要組成亞基bamA，bamB和bamD。首先比較這些敲除菌株對細菌膜蛋白的表達影響，SDS-PAGE發現7條差異條帶，質譜鑒定結果顯示至少有5個外膜蛋白，并利用Western blotting驗證部分蛋白的變化。結果發現，嗜水氣單胞菌bamA、bamB和bamD的缺失突變均引起本研究中選取的4個外膜蛋白在細胞膜水平上的表達下降，除了BamD在Ferrichrome receptor的轉運中起較為重要的作用以外，BamA、BamB和BamD對其他外膜蛋白轉運均起重要的作用；研究還發現，在細菌胞漿組分中，不同BAM復合物亞基似乎對特定外膜蛋白表達的影響也有所不同，例如BamB蛋白在外膜蛋白Maltoporin的表達中起決定性作用，BamA次之；Colicin I receptor和 Ferrichrome receptor的表達，則主要取決于BamD蛋白；而BamA，BamB和BamD在TonB-dependent copper receptor與BamD的表達中起相近的貢獻，提示BAM系統的變化不僅影響外膜蛋白在膜蛋白組分上的轉運，還可能通過某種途徑影響外膜蛋白的調控表達。值得提出的是，在大腸桿菌中敲除bamA或者bamD基因以后，均導致細菌外膜蛋白不能正確折疊進入外膜而導致細菌死亡，而本研究中敲除嗜水氣單胞菌的相應基因后只引起細菌生長略緩慢（數據未顯示），并未造成細菌的致死，這可能與試驗中pUTKm載體介導的突變并未完全無痕敲除目的基因有關，也有可能由這兩個蛋白在BAM系統中的作用與大腸桿菌等細菌的差異導致。以上研究與在大腸桿菌中相應復合物功能的結論有略微不同，提示嗜水氣單胞菌BAM轉運系統可能還具有特定的外膜蛋白轉運與折疊特性。

4 結論

本研究成功構建了bamA、bamB、bamD缺失突變株，SDS-PAGE分析發現7條差異條帶，質譜技術鑒定獲得至少5個差異外膜蛋白，進一步的Western blot分析發現bamA、bamB和bamD的缺失均能不同程度地影響嗜水氣單胞菌外膜蛋白的轉運。

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