益母草堿在大鼠急性內毒素性葡萄膜炎 模型中的保護作用

熊佳偉 顧紀鋒 石碗如 吳甦潛 麥爾哈巴·肖開提 朱依諄 莫曉芬△

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院眼科, 2藥劑科 上海 200031; 3澳門科技大學藥學院 澳門 999078;4復旦大學藥學院藥理學與生物化學教研室 上海 201203)

益母草堿(leonurine,SCM-198)作為益母草主要活性成分之一,最初因其在心腦血管系統疾病中能夠發揮抑制血小板聚集、降低外周血管阻力、減輕氧化應激損傷、調節L型Ca2+通道活性等作用而受到關注[1-3]。進一步研究發現,它還能通過下調TLR4及NF-κB活化,影響一系列下游信號轉導通路,在全身多種炎癥性疾病中發揮強大的抗炎作用,且無明顯不良反應[4-6]。眼科多種疾病(如葡萄膜炎等)均與炎癥關系密切。由于血-房水屏障(blood-aquaous-barrier,BAB)、血-視網膜屏障(blood-retina-barrier,BRB)等血-眼屏障的存在,全身給藥的抗炎治療效果不明顯、不良反應大,而局部治療(如眼內注射等)又存在并發癥風險等問題,故亟需尋找抗炎作用穩定、給藥方便、不良反應可控的新藥。SCM-198在急性乳腺炎、急性腎損傷等動物模型的前期研究中已被證實具有穩定的抗炎作用[5-6],且作為小分子化合物,其可透過血-眼屏障,由此帶來其在眼科疾病治療方面潛在的應用前景。本研究系首次在葡萄膜炎大鼠模型上開展益母草堿作用的研究,通過灌胃方式給藥,研究了 SCM-198在SD大鼠急性內毒素性葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis,EIU)模型中的保護作用,并初步探討可能的作用機制。

材 料 和 方 法

動物、主要試劑及儀器SPF級雄性SD大鼠36只(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司),初始體重180～200 g。0.9% NaCl注射液(浙江天瑞藥業有限公司);地塞米松磷酸鈉注射液(山東辰欣藥業股份有限公司);SCM-198(復旦大學藥學院朱依諄教授課題組惠贈);甲苯塞嗪鹽酸鹽(美國Sigma Aldrich公司);鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業有限公司);S.typhiLPS(美國Sigma Aldrich公司);TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1一抗,對應二抗(英國Abcam公司),BCA試劑盒(美國Sigma Aldrich公司)。33 Ga顯微注射器(瑞士Hamilton公司);Espion E2小動物ERG檢測系統(美國Diagnosys公司);眼科顯微手術系統(蘇州六六視覺科技股份有限公司)。

實驗方法及檢測指標記錄體重后將全部大鼠隨機分為3組:陰性對照組6只,每日0.9% NaCl注射液10 mL/kg體重灌胃;陽性對照組6只,每日50 mg/L地塞米松磷酸鈉溶于生理鹽水注射液10 mL/kg體重灌胃;實驗組4個亞組、每個亞組6只,分別以每日每千克體重10、20、40、80 mg的SCM-198生理鹽水灌胃。共21天,組間飼養無差異,其間每7天記錄體重。第18天灌胃結束后,各組大鼠以加入0.018 75 g/mL甲苯塞嗪鹽酸鹽的0.05 g/mL鹽酸氯胺酮注射液4 mL/kg體重腹腔注射麻醉、充分暗適應(2 h)后行ERG檢測;第21天灌胃后以1 g/L的傷寒沙門氏菌(S.typhi) LPS生理鹽水溶液0.1 mL于全部大鼠左足底注射建立EIU模型[7],造模后24 h再次如上麻醉并行ERG檢測;之后由2位有經驗的眼科醫師于雙盲下行裂隙燈下雙眼炎癥評分[8],方法如表1,33 Ga顯微注射器于手術顯微鏡下取左眼房水(-80 ℃保存)后處死動物。即刻取右眼眼球,固定后石蠟包埋切片,HE染色,光學顯微鏡下圖像采集觀察,留取白片,免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色檢測TNF-α、ICAM-1的表達。對留取的房水解凍、BCA法測定蛋白濃度,Western blot檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、細胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)表達。

表1 大鼠葡萄膜炎臨床評分指標Tab 1 Scoring system for clinical evaluation of uveitis [8]

結 果

TimeSCM-198 (mgkg-1d-1)80 402010Negative control Positive control Before235±27235±28235±32221±29230±29234±277th day274±19277±11272±34255±49260±29216±2914th day269±31286±27276±32268±53271±37209±2621st day265±25296±32277±27285±54278±34188±16

ItemSCM-198 (mgkg-1d-1)80 402010Negative controlPositive controlOS3.29±1.073.50±1.243.25±1.983.00±1.763.36±1.801.75±0.89OD3.21±1.373.50±1.243.38±1.773.10±1.793.27±1.901.88±1.13

OS:Oculus sinister;OD:Oculus dexter.

圖1 各組大鼠虹膜睫狀體(A)和玻璃體視網膜(B) HE染色結果Fig 1 The HE staining results of iris and ciliary body (A),retina and vitreous (B) in rats

圖2各組大鼠TNF-α(A)和ICAM-1(B)IHC檢測結果
Fig2TheIHCresultsofTNF-α(A)andICAM-1(B)inrats

圖3各組大鼠房水Westernblot結果
Fig3TheWesternblotresultsofaqueoushumorinrats

討 論

與炎癥相關的眼部病變是不可逆性致盲的重要原因,如葡萄膜炎,好發于中青年人群,多與自身免疫因素相關、可伴或不伴全身疾病,可復發緩解,臨床治療較為棘手。基礎和臨床研究亦證實,糖尿病視網膜病變發病過程中,長期低度炎癥反應刺激是病情進展的重要原因[9-10]。傳統抗炎治療以激素、免疫抑制劑等藥物為主,局部或全身應用均有較為明顯的不良反應,眼部長期應用激素可致激素性青光眼、白內障,免疫抑制劑局部應用刺激性較強;全身應用激素可致體型改變、骨質疏松、消化道潰瘍等,免疫抑制劑長期應用影響生育功能、升高惡性腫瘤發病風險等。綜上,傳統藥物治療炎癥相關性眼病受到較大限制。本研究中,雖然地塞米松能在EIU模型大鼠中發揮較強的抗炎作用,但該組大鼠處于高分解代謝狀態、體重顯著減輕且顯著低于其他各組,存在明顯不良反應,該項結果也與既往研究結果一致。造模前ERG檢測結果顯示,各組大鼠視網膜功能未見異常,亦未見其他不良反應,可見SCM-198和地塞米松以本研究所用劑量灌胃21天,眼部安全性良好。

SCM-198近年來被證實可在多器官、系統中發揮明顯的抗炎作用。其作用機制主要有兩種途徑,一是以直接下調TLR4活化為核心,TLR4廣泛存在于巨噬細胞等炎癥細胞表面,下調其活化可降低多種炎癥介質表達[5,11-12];二是以下調NF-κB活性為核心,進而下調IκB水平,抑制PI3K/Akt、ERK/MAPK、AP-1等多條下游通路,降低多種炎癥因子表達[4-6]。本研究所采用的EIU模型中,LPS誘導急性內毒素性葡萄膜炎的發病機制主要是LPS經血液循環,作用于葡萄膜固有組織巨噬細胞表面TLR4,激活巨噬細胞釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子,并進一步上調其他炎癥因子如IL-6的表達,IL-6進一步激活巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等[13];同時LPS誘導的感染應激狀態下ROS大量產生,進而激活NF-κB,升高下游炎癥介質的表達[6,14]。因此,SCM-198針對性下調上述通路的激活,進而下調對應炎癥因子表達,這種變化在本研究中也得到了形態學變化的佐證,因此SCM-198在EIU模型中的抗炎作用是明確的。然而,人類葡萄膜炎病理生理機制仍待明確,遠比EIU模型復雜。已證實的包括BAB和BRB破壞導致的炎癥細胞浸潤、多種炎癥介質過表達,周圍炎癥細胞暴露于細胞因子和趨化因子環境中引發的級聯反應,及ROS激活導致的多條下游信號通路激活產生的級聯反應等。因此SCM-198在臨床工作中的價值有待深入研究。

本研究采用的模型是LPS介導的急性全葡萄膜炎。既往文獻報道,大鼠造模后4 h內出現虹膜血管擴張、睫狀充血,6 h出現前房閃輝、細胞和纖維素滲出、18～24 h炎癥反應達到最高峰[7,15],48 h左右炎癥反應開始緩解并在4～7天后完全消失[15]。炎癥因子中表達最先上升的是TNF-α和IL-1β,二者能夠上調IL-6的表達,造模后24 h IL-6表達顯著升高;炎癥恢復期則表現為IL-10、IL-12、TGF-β等保護性因子表達上升[13,16]。本研究取樣的時點是造模后24 h的炎癥反應最高峰。因此裂隙燈下和組織病理學形態均觀察到明顯變化。由于TNF-α和IL-1β是最先出現的炎癥因子,故其表達變化和SCM-198對其產生的抑制作用最為明顯,甚至表達低于陽性對照組;IL-6出現晚于兩者,故雖觀察到SCM-198的和DEX對其表達的抑制作用,但各組間差距不如前兩者明顯。

眼科炎癥相關性疾病一直以來是治療難點和研究熱點。近年來傳統藥物單體、單克隆抗體研發成為熱點研究方向。日本學者報道茜草素在EIU模型抗炎中取得良好效果[19-20],其作用機制也與減輕氧化應激損傷及后續級聯反應相關,與本研究異曲同工。多個TNF-α單克隆抗體治療HLA-B27相關性葡萄膜炎的臨床試驗也取得成效[21]。此類藥物與傳統抗炎藥物作用機制不同,靶向更精準,因而不良反應更輕微、可控,未來發展前景廣闊。本研究中選取的SCM-198已是應用于臨床的成熟藥物,未來如能應用于眼科領域,將為此類疾病治療作出貢獻。

下一步研究中,我們將致力于對SCM-198應用于眼部抗炎的最佳給藥方式、給藥劑量給出更深入的回答。總之,SCM-198灌胃給藥對EIU模型大鼠具有保護作用,SCM-198作為潛在的眼科抗炎藥物,值得進一步研究。

參 考 文 獻

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