老年小鼠血腦屏障在術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的作用

朱紅花 方 浩

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院麻醉科 上海 201508)

老年患者手術(shù)麻醉后經(jīng)常發(fā)生術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD),表現(xiàn)為注意力、近期記憶、社會行為和語言理解能力的損害[1-3]。POCD可降低生活質(zhì)量,延長患者的住院時間,影響恢復(fù)過程[1-4],是一種65歲以上老年患者經(jīng)常發(fā)生的手術(shù)并發(fā)癥,具體機制尚不明確。

血腦屏障(blood brain barrier)是一個將中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血液循環(huán)相隔離的多細胞血管結(jié)構(gòu)。BBB通過保護大腦免受毒素和病原體侵害,保持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,維持神經(jīng)元的正常功能。生理狀態(tài)下,BBB的內(nèi)皮細胞形成連續(xù)的細胞間網(wǎng)絡(luò)緊密連接。咬合蛋白claudin-5和閉合蛋白occludin是緊密連接蛋白的關(guān)鍵部件[5],并有基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)裂解位點,可以通過從細胞外基質(zhì)分離內(nèi)皮細胞,破壞血腦屏障。有研究發(fā)現(xiàn),血腦屏障功能降低可導(dǎo)致年齡相關(guān)性認(rèn)知功能障礙[6]。同時也有研究發(fā)現(xiàn),手術(shù)可影響血腦屏障的滲透和功能[7]。另一方面,MMP的活化能降低缺血性卒中的claudin-5和occludin表達,增加血腦屏障通透性。因此我們推測,POCD可能與血腦屏障的破壞有關(guān),而MMP和緊密連接蛋白的變化可能是術(shù)后血腦屏障破壞的原因。

材 料 和 方 法

實驗動物健康雄性C57BL/6小鼠(18月齡)由上海斯萊克實驗動物有限公司提供,飼養(yǎng)于具有層流系統(tǒng)的無菌環(huán)境,維持室溫23 ℃,晝夜周期12 h輪轉(zhuǎn),給予充足的食物和水。將小鼠隨機分為3組:對照組(C組,n=10),動物不予任何干預(yù);手術(shù)組(S組,n=10),動物在全身麻醉下接受闌尾切除術(shù),腹腔注射0.5%戊巴比妥0.2 mL。腹正中切口1～2 cm暴露闌尾,切除闌尾后無菌縫合縫扎緊盲端,并縫合傷口;吸入組(I組,n=10),將小鼠放在一個連接異氟醚揮發(fā)罐的透明箱子內(nèi)(30 cm×15 cm×15 cm),在箱內(nèi)吹入1.2%異氟烷和100%氧氣1 L/min,維持2 h。3組小鼠分別在干預(yù)后第3天和第30天進行水迷宮實驗(Morris Water Maze)。于第1、3、7、14天采用伊文思藍(Evans-blue,EB)透過率檢測各組海馬區(qū)血腦屏障通透性的改變,并通過Western blot檢測occludin和claudin-5蛋白,觀察手術(shù)后緊密連接蛋白的變化,并檢測MMP-2和MMP-9的改變。

水迷宮實驗水迷宮實驗是一種檢測嚙齒類動物依賴于海馬的空間學(xué)習(xí)能力的方法。圓形水槽(直徑80 cm)內(nèi)充滿(22±1)℃不透明水,四周貼有如正方形、菱形等不同圖形,隱藏平臺低于水面1 cm,實驗鼠要根據(jù)這些圖形來找到水面下的隱藏平臺,記錄時間作為潛伏期。第1～5天每天從4個入水點中隨機選1個點將小鼠面向池壁放入水中,60 s內(nèi)未找到平臺的小鼠由測試者引導(dǎo)其上臺停留15 s,第6天時移走平臺進行測試。通過安裝在天花板上的攝像機記錄,用水迷宮軟件對數(shù)字圖像進行分析,記錄平臺穿越次數(shù)和潛伏期時間。

血腦屏障通透性測定方法采用EB外滲法測定血腦屏障通透性。2% EB染料(4 mL/kg)經(jīng)小鼠尾靜脈注射。3 h后待染料充分經(jīng)過血循環(huán)后,每組取6只小鼠,用0.2 mL戊巴比妥鈉腹腔注射,并用50 mL生理鹽水通過左心室進行灌注后取海馬。每個海馬浸于1 mL甲酰胺(美國Sigma-Aldrich公司)。樣品于37 ℃孵育2 h后,甲酰胺混懸液經(jīng)420 000×g離心20 min,測量每份海馬在632 nm的吸光度(D)。EB染料含量根據(jù)甲酰胺內(nèi)EB的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算(0～4μg/mL)。

Westernblot檢測分離小鼠海馬組織,加入NP-40裂解液,加PMSF并研磨勻漿,然后15 000×g,離心10 min。以2倍上樣緩沖液50μL裂解,然后收取細胞,置于沸水中徹底變性5 min。取10μL樣品,進行10% SDS-PAGE電泳。將膜浸入5%脫脂奶粉封閉液中緩慢振蕩90 min,用PBST液洗滌3次,每次5 min,加入1∶5 000稀釋鼠抗β-微管蛋白和1∶1 000稀釋抗claudin-5/抗occludin,4 ℃放置過夜,用PBST液洗滌3次,每次10 min;加二抗1∶2 000稀釋羊抗鼠和羊抗兔IgG-HRP,室溫放置1 h,用PBST洗滌3次,每次10 min。相同體積兩種液體混合后滴加在膜上,進行發(fā)光拍照。

結(jié) 果

闌尾切除術(shù)和吸入麻醉對認(rèn)知功能的影響闌尾切除術(shù)和1.2%異氟醚暴露后,小鼠在術(shù)后第3天(D3)和第30天(D30)進行水迷宮測試以評估空間學(xué)習(xí)記憶,D3和D30分別代表近期記憶和遠期記憶。相比對照組和吸入組,手術(shù)組小鼠術(shù)后3天的潛伏期明顯延長(P<0.05,圖1A),平臺跨越次數(shù)顯著減少(P<0.05,圖1B),3組在術(shù)后30天時組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3組小鼠的游泳速度無差異(圖1C),表明手術(shù)組和其他兩組之間潛伏期及平臺穿越次數(shù)之間的差異和運動缺陷無關(guān)(表1)。上述結(jié)果表明,手術(shù)可引起短暫的認(rèn)知功能受損,但不引起遠期認(rèn)知功能受損。暴露于1.2%異氟醚2 h并沒有引起認(rèn)知功能障礙。

(1)P< 0.05.

圖1水迷宮試驗測得3組老年小鼠的潛伏期、平臺穿越次數(shù)和游泳速度
Fig1Resultsoflatency,timescrossingplatformandswimmingspeedinMorrisWaterMazetestofthreegroupsofagedmice

Control groupSurgery groupInhalation groupLatency (s) D325.18±4.6035.91±4.53(1)(2)28.16±5.68 D3020.35±3.8423.01±11.8218.49±14.33Times crossing platform D34.50±0.933.00±0.76(3)(4)4.22±120.00 D304.17±0.753.60±0.893.33±1.37Swimming speed (m/h) D3143.50±30.60153.02±31.90153.35±33.16 D30140.91±22.46134.71±14.54133.79±25.08

vs.Control group,(1)P<0.001,(3)P=0.003;vs.Inhalation group,(2)P=0.008,(4)P=0.026.

闌尾切除術(shù)對血腦屏障的破壞EB是一種無毒的染料,能結(jié)合血清白蛋白,在正常生理條件下幾乎不穿過血腦屏障。在血腦屏障通透性增加的情況下EB-白蛋白復(fù)合物才有可能進入腦組織。由于這

一特性,EB被廣泛用于檢測血腦屏障的完整性。與對照組及吸入組相比,手術(shù)組在實驗后第1、3天EB定量顯著提高,這一變化在第7天依然存在(P<0.05),在第14天時恢復(fù)正常基線,提示闌尾切除手術(shù)可導(dǎo)致血腦屏障通透性增加,而異氟醚吸入對血腦屏障通透性沒有影響(圖2,表2)。

(1)P< 0.05.

圖23組老年小鼠的海馬血腦屏障通透性
Fig2Permeabilityofbloodbrainbarrierofhippocampusinthethreegroupsofagedmice

表23組老年小鼠海馬內(nèi)的EB數(shù)定量
Tab2Evansblueinhippocampalinthethreegroupsofagedmice

GroupD1D3D7D14Control 19.69±2.8619.19±4.0418.36±3.6119.86±3.55Surgery 34.12±4.74(1)32.84±5.64(2)28.01±3.87(2)23.88±6.88Inhalation 21.21±4.99(3)20.11±5.21(4)21.18±4.28(5)22.43±4.78

vs.Control group,(1)P<0.001,(2)P=0.001;vs.Surgery group,(3)P=0.001,(4)P=0.002,(5)P=0.016.

維持血腦屏障低通透性的一個重要原因是緊密連接蛋白。occludin和claudin-5是兩種重要的緊密連接蛋白,許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可導(dǎo)致血腦屏障的破壞。我們分析了老年小鼠在經(jīng)過闌尾切除術(shù)后第1、3、7、14天海馬內(nèi)occludin和claudin-5蛋白水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,手術(shù)組小鼠海馬內(nèi)occludin表達在術(shù)后第1天顯著降低(P<0.05),術(shù)后第3、7天依然低于正常,但呈現(xiàn)逐漸恢復(fù)趨勢,術(shù)后第14天時完全恢復(fù)正常;而手術(shù)組與對照組比較claudin-5表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A、3B)。MMP-2和MMP-9通過破壞神經(jīng)血管間距和減少緊密連接蛋白而破壞血腦屏障。我們在術(shù)后第1、3、7、14天檢測了MMP-2和MMP-9蛋白質(zhì)水平,發(fā)現(xiàn)術(shù)后第1天MMP-9升高,并和occludin的下降一致,于術(shù)后第14天回歸基線。而MMP-2的變化由術(shù)后第3天開始,在第7天仍然持續(xù),第14天回歸正常(圖3C、3D)。

(1)vs.group C,P<0.05.C:Control group (n=6).

圖3闌尾切除術(shù)后老年小鼠海馬內(nèi)occludin、claudin-5、MMP-2和MMP-9的蛋白表達
Fig3Proteinexpressionsofoccludin,claudin-5,MMP-2andMMP-9inhippocampusofagedmiceafterappendectomy

討 論

POCD是指麻醉和手術(shù)后出現(xiàn)的認(rèn)知功能改變,包括記憶能力下降、注意力不能集中等,更嚴(yán)重的表現(xiàn)還有人格改變和社會行為能力下降[1]。還有一部分患者甚至發(fā)展為不可逆的認(rèn)知障礙[2],嚴(yán)重降低生活質(zhì)量,增加術(shù)后死亡率。

麻醉和外科手術(shù)是引起POCD的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往大量有關(guān)POCD 的機制研究多集中在全身麻醉藥物,認(rèn)為揮發(fā)性吸入麻醉藥(如異氟醚)是引起POCD 的主要原因[3-4]。然而臨床研究卻發(fā)現(xiàn),即使不應(yīng)用全麻藥,在局部麻醉下手術(shù)仍然可能發(fā)生POCD[8-9],因此手術(shù)因素在POCD發(fā)生過程中的作用不容忽視。動物實驗也證明不應(yīng)用吸入麻醉藥,而采用芬太尼加氟哌利多麻醉下行脾臟切除術(shù),動物的學(xué)習(xí)和記憶能力也出現(xiàn)明顯下降,而單純麻醉對于動物的學(xué)習(xí)和記憶并沒有影響[10]。此外,Togo等[11]和Cibelli等[12]的研究也證明,脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)可以造成術(shù)后短暫的學(xué)習(xí)和記憶能力下降。在本研究中,手術(shù)組在術(shù)后第3天時的潛伏期延長,平臺穿越次數(shù)減少,表明手術(shù)組發(fā)生了認(rèn)知障礙,而吸入組并沒有發(fā)生認(rèn)知學(xué)習(xí)障礙。另一方面,在第30天時各組之間的認(rèn)知功能并無差異,提示手術(shù)對認(rèn)知的影響在短期內(nèi)明顯,而長期持續(xù)性的傷害并不確定。此外,單純的吸入麻醉并不會影響老年小鼠的長期和短期認(rèn)知功能。

POCD發(fā)生機制復(fù)雜,目前對血腦屏障的關(guān)注日益增加。血腦屏障主要由腦微血管內(nèi)皮細胞、基底膜、星形膠質(zhì)細胞和周細胞構(gòu)成,能防止病原體和毒素等大分子物質(zhì)擴散進入腦實質(zhì),神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定才得以維持。有實驗顯示血腦屏障功能降低部分作用于年齡相關(guān)的認(rèn)知功能紊亂[13]、高血壓和2型糖尿病[14]。最近的研究發(fā)現(xiàn),吸入麻醉[15]和外科手術(shù)[16]對血腦屏障通透性和功能有不利影響,所以術(shù)后認(rèn)知功能的下降可能與血腦屏障的破壞有關(guān)。本實驗通過檢測EB通透性發(fā)現(xiàn),和對照組及吸入組相比,手術(shù)組術(shù)后第1、3天的EB定量顯著提高,這一變化在第7天依然存在,在第14天時恢復(fù)正常基線,提示闌尾切除手術(shù)可導(dǎo)致血腦屏障功能通透性降低,而單純吸入麻醉對血腦屏障通透性無影響。

為進一步闡明手術(shù)增加血腦屏障通透性的機制,我們觀察了緊密連接蛋白的變化。緊密連接蛋白是密封相鄰內(nèi)皮細胞的間隙,從而限制跨越血腦屏障的分子轉(zhuǎn)運。緊密連接蛋白保持了血腦屏障的低通透性。occludin和claudin-5在由血腦屏障破壞所致的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起重要作用。occludin的緊密連接是保持血腦屏障完整性的重要因素之一,它是首個被分離出來組成緊密連接的完整膜蛋白[17],是緊密連接蛋白的主要結(jié)構(gòu)蛋白。血腦屏障通透性明顯低于其他血組織屏障的重要原因是occludin在腦組織血管內(nèi)皮的表達明顯高于非神經(jīng)組織的血管內(nèi)皮,當(dāng)轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的occludin表達均受到抑制時,緊密連接蛋白崩解造成緊密連接開放,血腦屏障完整性受損。claudin參與維持緊密連接的選擇滲透性和細胞極化,是緊密連接復(fù)合物的另一主要構(gòu)成成分[18]。claudin-3和claudin-5在腦微血管循環(huán)內(nèi)皮系統(tǒng)中表達豐富,有研究認(rèn)為claudin-5是構(gòu)成血腦屏障的主要跨膜蛋白[19]。這些都說明occludin及claudin-5的表達與血腦屏障的低滲透功能關(guān)系密切。我們發(fā)現(xiàn),與對照組比較,手術(shù)組小鼠海馬occludin的表達在術(shù)后第1天顯著降低(P<0.05),并于術(shù)后第3天和第7天逐漸恢復(fù),于術(shù)后第14天恢復(fù)正常。說明手術(shù)后occludin表達減少,從而導(dǎo)致血腦屏障的完整性受到破壞。而本實驗并未發(fā)現(xiàn)claudin-5有顯著性改變,其原因有待進一步研究。

許多細胞因子[20]、蛋白酶[21]和MMP22]都能通過影響緊密連接蛋白而破壞血腦屏障功能。MMP等通過降低occludin和claudin-5的表達破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)。MMP是一組鋅、鈣依賴性蛋白水解酶家族,在降解細胞外基質(zhì)過程中起主要作用。在生理條件下,MMP主要以無活性的酶原形式存在,在炎性介質(zhì)作用下轉(zhuǎn)化為活性成分,其中與血腦屏障關(guān)系最為密切的是明膠酶,明膠酶包括MMP-2和MMP-9。MMP-2和MMP-9通過破壞神經(jīng)血管間距和減少緊密連接蛋白而破壞血腦屏障。基于以上原因,我們在手術(shù)后第1、3、7、14天檢測了MMP-2和MMP-9,結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后第1天 MMP-9升高,并和occludin的下降一致,于術(shù)后第14天回歸基線。而MMP-2的變化由術(shù)后第3天開始,并在第7天仍然持續(xù),第14天時回歸正常。因此我們認(rèn)為,手術(shù)可導(dǎo)致MMP-9激活,從而破壞緊密連接蛋白occludin,引起血腦屏障通透性改變,導(dǎo)致一系列腦內(nèi)變化,并最終導(dǎo)致POCD。

本研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)能引起POCD,并導(dǎo)致血腦屏障破壞,緊密連接蛋白下降和MMP-2、MMP-9水平升高可能參與了血腦屏障破壞。雖然老年小鼠闌尾切除術(shù)后發(fā)生血腦屏障破壞,但仍很難確定血腦屏障的破壞是POCD的主要原因。今后有必要進一步明確,是血腦屏障破壞導(dǎo)致的一系列損傷還是損傷導(dǎo)致BBB的破壞,我們將通過干預(yù)MMP進一步研究血腦屏障在POCD中的作用。

參 考 文 獻

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