新型超臨界流體色譜儀在糖類分離分析中的應用研究

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(1.大連大學環境與化學工程學院，大連 116622；2.江蘇漢邦科技有限公司，淮安 223005)

糖是人體熱能的最主要來源，其分離分析方法備受關注。傳統的GC法分離分析糖類雖然具有靈敏度高、快速等優點，但由于糖類的揮發性小，常需要衍生。目前常用的方法是HPLC法，無需衍生化，可與多種檢測器聯用。在HPLC法中，為了獲得好的分離效果，通常使用糖分析柱(氨基柱)，價格昂貴。謝強勝等[1]采用HPLC法測定橘紅丸及蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量，用prevail carbohydrate ES色譜柱,乙腈-水(體積比77∶23)為流動相,蒸發光散射檢測器(ELSD)檢測。果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖在0.1～1.7 μg/mL范圍內有良好的線性關系,相關系數(r)為0.99以上;檢出限達到0.0104 μg/mL。樣品中糖的加標回收率為96.6%～101.0%,測定結果的相對標準偏差為0.58%～0.28%(n=5)。實際樣品檢測結果顯示,多批橘紅丸和蜂蜜樣品中4種糖含量存在明顯差異,該方法可用于橘紅丸中蜂蜜輔料的質量考察。沈少林等[2]采用HPLC-蒸發光散射法同時測定了蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖。杜學慧等[3]也采用HPLC法測定了蜂蜜中的果糖、葡萄糖和蔗糖。岳紅等[4]采用HPLC法測定了發酵乳中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及乳糖含量。

超臨界流體色譜(Surpercritical Fluid Chromatography,簡稱SFC)是以超臨界流體作為流動相，以固體吸附劑或鍵合到載體上的高聚物為固定相，利用流動相的溶劑化能力來進行分析、分離的色譜過程[5，6]。SFC結合了GC和HPLC二者的特點，既可分析GC不適應的高沸點、低揮發、不穩定的高分子、生物大分子樣品，又比LC有更高的柱效率和更快的分析速度，同時在與多種檢測器聯用和制備方面也比HPLC更具優勢。加之最常用的做流動相的超臨界流體是CO2，廉價易得，后處理簡單，符合節約、環保的理念。由于缺乏商品化的儀器，SFC的發展受到限制，一直沒有HPLC應用廣泛。近年來，國外儀器廠商開始進行SFC的儀器研發，目前幾個知名廠家已經實現了儀器的商品化，國內SFC的研制剛初具規模，儀器的商品化才剛剛起步。

本研究中使用自行研制的超臨界流體色譜系統，成功分離了木糖、葡萄糖、蔗糖，考察了有機改性劑種類、濃度、系統背壓、流速、溫度對分離度的影響，得到了較好的分離結果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

NS8001超臨界流體色譜儀，江蘇漢邦科技有限公司；Alltech-ELSD3300蒸發光散射檢測器，美國奧泰。

葡萄糖,分析純，蔗糖，分析純，科密歐化學試劑有限公司；D-(+)-木糖,純度99%,上海寶曼生物科技有限公司；CO2，純度99.99%，N2，純度99.95%，洪澤寧淮特種氣體有限公司；甲醇，純度99.95%，乙腈，純度99.95%，江蘇漢邦科技有限公司；乙醇，純度99.95%，異丙醇，分析純，國藥試劑有限公司。Hedera C18(4.6*250mm,5μm)、Hedera Si (4.6*250mm,5μm)、Hedera Diol (4.6*250mm,5μm)、Hedera PhenyI (4.6*250mm,5μm)、Hedera CN(4.6*250mm,5μm)色譜柱，江蘇漢邦科技有限公司。

1.2 樣品配制

葡萄糖、蔗糖、木糖3種混合樣品各10mg，溶于3mL水中。

1.3 實驗條件

總流速2mL/min，CO2流速1.6mL/min，改性劑流速0.4mL/min，操作壓力12 MPa，溫度40℃，蒸發溫度60℃，N2載氣流速1.6mL/min。

2 結果與討論

2.1 色譜固定相對分離的影響

在1.3的實驗條件下，加入20%甲醇作為改性劑，對木糖、葡萄糖、蔗糖在硅膠、苯基、氰基、二醇基和C185種固定相上的保留行為進行了對比，分離結果見圖1。所用的色譜柱為Hedera C18(4.6*250mm,5μm)、Hedera Si (4.6*250mm,5μm)、Hedera Diol (4.6*250mm,5μm)、Hedera PhenyI (4.6*250mm,5μm)、Hedera CN(4.6*250mm,5μm)。

圖1 不同固定相上木糖、葡萄糖、蔗糖的SFC分離譜圖

由圖1可見，3種糖在硅膠柱上有較好的分離，出峰順序為木糖、葡萄糖、蔗糖，本節后續實驗均在硅膠柱上進行，出峰順序不變。

2.2 改性劑種類對分離的影響

在1.3的實驗條件下，在Hedera Si(4.6*250mm,5μm)色譜柱上對木糖、葡萄糖、蔗糖進行分離，當分別加入20%甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、乙醇(EtOH)、異丙醇(IPA)、乙腈-甲醇5種不同改性劑時，結果如圖2。

圖2 不同改性劑條件下木糖、葡萄糖、 蔗糖的SFC分離譜圖

由圖2 可見，加入甲醇時分離效果較好。

2.3 背壓對分離的影響

在1.3的實驗條件下，在Hedera Si(4.6*250mm,5μm)色譜柱上對木糖、葡萄糖、蔗糖進行分離，加入20%甲醇為改性劑，背壓從8MPa上升至16MPa，得到了圖3的實驗結果。

圖3 不同背壓條件下木糖、葡萄糖、蔗糖的SFC分離譜圖

由圖3可見，背壓變化對3種糖的分離影響很小。

2.4 改性劑流速對分離的影響

在1.3的實驗條件下，在Hedera Si(4.6*250mm,5μm)色譜柱上對木糖、葡萄糖、蔗糖進行分離，加入20%甲醇為改性劑，流速從1.5mL/min上升至3.5mL/min，得到了圖4的實驗結果。

圖4 不同流速條件下木糖、葡萄糖、蔗糖的SFC分離譜圖

由圖4可見，改性劑流速增大，保留時間縮短。

2.5 改性劑比例對分離的影響

在1.3的實驗條件下，在Hedera Si(4.6*250mm,5μm)色譜柱上對木糖、葡萄糖、蔗糖進行分離，加入甲醇為改性劑，比例從10%上升至40%，得到了圖5的實驗結果。

圖5 不同比例改性劑條件下木糖、葡萄糖、蔗糖的SFC分離譜圖

由圖5可見，比例增大，保留時間會縮短，但是分離度會減小。

3 結論

采用NS8001超臨界流體色譜儀成功分離了木糖、葡萄糖、蔗糖，同時考察了固定相種類、有機改性劑種類、系統背壓、改性劑流速、改性劑比例對分離度的影響，結果表明：在考察的5種代表性固定相中，樣品在硅膠固定相上被很好的分離。有機改性劑種類及濃度對分離均有影響，在5種常用改性劑中，甲醇為改性劑時分離效果最好，且改性劑濃度越大，洗脫能力越強，分離度越小。流速越大，保留時間越短。該實驗拓展了國產新型超臨界流體色譜儀的應用范圍。

[1] 謝強勝，李啟艷，王坤，劉春霖.化學分析計量，2013,22(1)：45-47.

[2] 沈少林，陸文琪，張慧雄.理化檢驗-化學分冊，2015,51(9)：1330-1332.

[3] 杜學慧，高艾英，張昊，張鵬.中國計量,2013.(7):84-86.

[4] 岳紅，趙貞，劉麗君，李翠枝，邵建波.乳液科學與技術，2017,40(2)：23-26.

[5] 陳青，劉志敏.分析化學，2004,32(8):1104-1109.

[6] 張怡評，洪專，方華，謝全靈，易瑞灶，吳皓.中醫藥導報，2012,18(7):89-91.