基于參數優化的核磁共振定量技術的建立

(首都醫科大學中心實驗室，北京 100069)

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)是具有自旋的原子核在外磁場作用下發生能級分裂，并在一定射頻照射的情況下發生躍遷的現象。核磁共振儀在有機化合物的結構鑒定方面發揮著重要的作用。

核磁共振技術除了用于解析化合物的化學結構外，也可作為一種定量分析方法，即定量核磁技術(quantitative NMR，QNMR)。核磁共振定量分析是以藥物結構分析為基礎的分析方法，是藥物定量分析領域的熱點和難點。核磁共振定量分析早在上世紀70年代就已提出來，但是由于儀器靈敏度低，測定的重現性差等條件限制，其綜合效果并不理想[1]。隨著現代超導高分辨磁場的脈沖傅立葉變換核磁共振儀靈敏度、分析速度的不斷提高，核磁共振定量分析方法相比于經典的高效液相色譜法、液質聯用、氣質聯用等方法具有其獨特的優勢[2]：

(1)對樣品測試范圍很廣，為通用型檢測手段，對任何含H的樣品都可以進行檢測；

(2)對樣品無破壞性，實驗完成后樣品可以回收；

(3)實驗過程不需要繪制標準曲線；

(4)樣品制備簡單，儀器檢測快速，對于不穩定的化合物尤為適用；

(5)同核/異核二維核磁技術，可以提供化合物的結構信息，可以同時完成化合物的定性與定量分析。

我國已于中國藥典2010版二部附錄IX中新加入了核磁共振波譜法[3]，核磁共振儀在藥物定性領域已得到較為普遍的應用，但是國內在核磁定量技術方面的研究剛剛起步，多偏重于原理及應用[4],關于如何優化儀器參數去獲取高精準度定量結果的研究,少見報道。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

500 MHz核磁共振儀(瑞士Bruker)，分析天平(satorius,BS124S)；液相色譜(安捷倫1200)。

1.2 材料與試劑

維生素C標準品(Sigma公司)；維生素C片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號5150619)；內標1,2,4,5-四甲基苯(sigma)；甲醇 (fisher,色譜純)；氘代DMSO(sigma，0.03%TMS)。

1.3 方法

1.3.1 優化儀器參數的標準品配制

精確稱取維生素C對照品0.0221 g，溶于氘代DMSO，加入5mm核磁管中，待其完全溶解，上機測試。

1.3.2 NMR供試品溶液配制

精確稱取研磨后的維生素片粉末5份(0.0124 g、0.0208 g、0.0226 g、0.0094 g、0.0134g)，分別加入內標1,2,4,5-四甲基苯(0.0021 g、0.0018 g、0.0028 g、0.0022 g、0.0023g)，溶于5份氘代DMSO，加入5mm核磁管中，超聲15分鐘，待其完全溶解，上機測試。

1.3.3 HPLC標準品溶液配制

精密稱取維生素C對照品0.0204 g，置于25mL容量瓶中，加流動相甲醇-0.1%磷酸(5∶95)溶解并稀釋至刻度，搖勻 ；精密量取1mL，置于25mL容量瓶中，再加入甲醇-0.1%磷酸(5∶95)稀釋至刻度，搖勻，即得標準品溶液(每1mL中含維生素C 32 μg)。

1.3.4 HPLC供試品溶液配制

維生素C片研磨后稱取0.0206 g，置于25mL容量瓶中，加流動相甲醇-0.1%磷酸(5∶95)溶解并稀釋至刻度，搖勻 ；精密量取1mL，置于25mL容量瓶中，再加入甲醇-0.1%磷酸(5∶95)稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液(每1mL中含維生素C 32 μg)。

1.3.5 核磁測定條件 ppm已經不允許使用

使用Bruker標準實驗參數PROTON，脈沖序列為zg30，譜寬SW 14.6160，中心頻率O1P 6.402，測試溫度300 K，觀察頻率500 MHz，脈沖寬度p1 13.42 μs，采樣時間AQ 1.58 s，延遲時間d1 1 s，掃描次數ns 32。

1.3.6 液相色譜條件

色譜柱：Kromasil C18(4.6mm×200mm×5μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸(5∶95)；柱溫：25℃；流速：1mL/min；檢測波長：242nm

2 結果與分析

2.1 定量特征峰、定量內標的選擇

QNMR所選內標應滿足純度高，能與被測樣品溶于同一種溶劑，不與被測樣品及溶劑反應，定量峰易于識別并且至少要保證有一組峰與被測物完全分離等要求[5]。因此，本實驗選用1,2,4,5-四甲基苯為定量內標，其苯環上的兩個質子在化學位移為δ6.87 處有一尖銳單峰，故選定此峰為內標定量特征信號峰。

維生素C為水溶性化合物，具有烯醇式己糖內酯立體結構，在水中易溶解，結構式和1H NMR見圖1。

圖1 維生素C的結構式和1H NMR譜

1H NMR譜峰歸屬如下：δ11.09 ppm、δ8.40 ppm分別對應羥基1-H、2-H質子信號，δ5.25 ppm對應于3-H質子信號，4-H質子信號與δ3.36 ppm水峰信號重疊，δ4.75 ppm對應于6-H質子信號，δ3.84 ppm對應于5-H質子信號，δ3.45 ppm對應于7-H質子信號。由圖可見，δ4.75 ppm質子信號易于識別，旁邊沒有別的信號干擾，因此本實驗利用該峰的積分值計算維生素C 的含量。

2.2 核磁定量參數優化

本實驗主要考察不同脈沖寬度、采樣時間、延遲時間、掃描次數[6-8]對實驗結果的影響。結果見表1～表4。

表1 不同p1對相對峰面積比的影響

隨著p1的增加，樣品定量峰與內標定量峰的積分面積比值隨之增大，因此本實驗選取p1=13.42 μs。

表2 不同AQ對相對峰面積比的影響

隨著AQ的增加，發現AQ=1.58s時As/Ar值最大，故本實驗選取AQ=1.58 s。

表3 不同d1對相對峰面積比的影響

隨著d1的增加，發現d1=1s時As/Ar值最大，故本實驗選取d1=1 s。

表4 不同ns對相對峰面積比的影響

隨著ns的增加，發現ns>32時As/Ar增加趨勢減慢，故本實驗選取ns=32。

2.3 1H NMR譜內標法測定維生素C

2.3.1 定量方法

測定前，使用標準管(90% H2O+10 % D2O)對儀器進行3D勻場，使用0.1% EB標準管精確校準探頭90°脈沖寬度。測試供試品的1H NMR譜圖，所有譜圖使用Bruker Topspin軟件處理，每個供試品的積分面積取5次積分的平均值。按公式(1)計算供試品中維生素含量[9]。公式用斜體

(1)

公式(1)中，W代表物質的質量；A代表定量峰積分面積；N代表定量峰所包含的質子數；M代表物質分子量；下標u和r分別為分析物和內標物。本實驗中Nu=1(Nu代表分析物δ4.75 ppm的積分面積為1)，Nr=2(Nr代表內標物δ6.87ppm的積分面積為2)，Mu=176.13，Mr=134.22。

2.3.2 含量測定

制備含有不同質量藥品的待測樣品5份，分別測定1H NMR，結果見表5。

由化學位移為δ4.75 ppm處信號峰面積Au計算結果為：5份樣品中維生素C的含量分別為81.4%、80.3%、81.4%、81.9%、82.1%，平均含量為81.4%，相對標準偏差RSD=0.86%。

表5 維生素C含量的核磁共振數據

2.4 HPLC測定維生素C

用單點校正法，定量進樣，根據被測組分和外標組分峰面積比或峰高比計算被測組分的含量，計算得維生素C的含量為79.5%。與核磁共振定量分析法測得的數據基本相符。

3 討論

由于核磁共振定量分析是以結構分析為基礎的分析方法，可以同步完成結構分析、定性分析和定量分析。同時核磁共振定量分析方法還具有簡單、準確、專一性高和不破壞樣品等優點。

本實驗通過優化核磁定量實驗中的各個參數，選定實驗中的最佳值，得到的定量結果與高效液相色譜定量分析方法的結果相符合。足夠的采樣時間可以保證自由衰減信號衰減完全，從而提高分辨率。合適的延遲時間可以保證譜圖強度不會被飽和，有利于對譜峰進行正確的積分。在儀器測試狀態調整到最優時，定量分析結構可以接近高效液相色譜法。

由本實驗可知，核磁共振定量分析法操作簡便，數據準確，可為后續其它藥物定量分析提供參考。

[1] Pauli G F,Jaki B U,Lankin D C.Quantitative1H NMR:development and potential of a method for natural products analysis[J].J Nat Prod,2004,68: 133-149.

[2] Hazekamp A,Choi Y H,Verpoorte R.Quantitative analysis of cannabinoids from Cannabis sativa using1H NMR [J].Chem Pharm Bull,2004,52: 718-721.

[3] 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典 [S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄81-83.

[4] Yu X B,Shen W B,Xiang B R.Advances in application of quantitative nuclear magnetic resonance technique in pharma-ceutical field[J].Prog Pharm Sci,2010,34: 17-23.

[5] Hu M,Hu C Q.Determination of drug reference substance content by1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy [J].Chin J Anal Chem,2004,32: 451-455.

[6] Ernst R R.Application of Fourier transform spectroscopy to magnetic resonance [J].Rev Sci Instrum,1966,37: 93-102.

[7] Malz F,Jancke H.Validation of quantitative NMR [J].J Pharm Biomed Anal,2005,38: 813-823.

[8] Pauli G F,Jaki B U,Lankin D C.Quantitative1H NMR: development and potential of a method for natural products analysis [J].J Nat Prod,2004,68: 133-149.

[9] Malz F,Jancke H.Validation of quantitative NMR [J].J Pharm Biomed Anal,2005,38: 813-823.