利拉魯肽誘導肥胖2型糖尿病大鼠白色脂肪組織中FGF21的表達及機制

張 楠，張 一，章 秋，魯云霞

(1. 安徽醫科大學附屬第一醫院內分泌科，安徽 合肥 230022；2. 安徽醫科大學生物化學教研室，安徽 合肥 230032)

由于全球肥胖或超重人群的逐年增加，導致胰島素抵抗、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)等代謝性疾病的發病率明顯上升[1]。新一代的降糖藥胰高血糖素樣肽-1類似物(glucagon-like peptide-1 analogues，GLP-1A)因具有獨特的降糖機制、安全有效的降糖效果及減輕體重的特點，成為內分泌代謝病領域的研究熱點。目前臨床上常用的GLP-1A包括利拉魯肽(liraglutide，LRG)、艾塞那肽、阿必魯泰等。

成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是一種新型的代謝調控分子，在包括肝臟、脂肪組織、胰腺等多個組織中都有表達，通過與輔助受體β-Klotho及FGF受體(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)結合，實現調控糖脂代謝的功能[2]。Chau等[3]研究表明，FGF21通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，增強線粒體氧化作用來調控脂肪細胞的能量平衡。GLP-1A可通過影響FGF21水平發揮作用。Yang等[4]報道，注射高劑量的利拉魯肽(1 mg·kg-1)，每日2次，連續8周，可增加高脂飲食脂聯素基因敲除大鼠血FGF21的水平，改善胰島素抵抗。利拉魯肽可誘導KKAy小鼠肝臟FGF21生成，改善肥胖和高血糖，并增加GLP-1活性[5]。近期研究表明，利拉魯肽通過激活脂肪組織中的固有天然殺傷T細胞(iNKT)，誘導其FGF21的表達來調節體重和血糖[6]。但是，利拉魯肽對肥胖T2DM白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)中FGF21水平及AMPK、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑的影響目前尚未見相關報道。本研究先建立肥胖T2DM大鼠模型，再予以利拉魯肽干預，觀察其對附睪脂肪組織細胞的形態學和FGF21表達、AMPK和MAPK信號通路的影響，以闡述其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 40只8周齡SD大鼠，♂，體質量(170±20)g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，每籠5只，溫度(20～25)℃，相對濕度35%～60%，自由攝食和進水，適應性飼養1周。

1.1.2藥物與試劑 利拉魯肽(諾和力)購自諾和諾德中國制藥有限公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自美國Sigma-Aldrich公司；RNAiso Reagent、逆轉錄試劑盒、Premix TaqTM購自大連寶生物工程有限公司；所有引物均采用Primer 5.0軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成；RIPA裂解液購自南京凱基生物科技有限公司；肝激酶B1(liver kinase B1, LKB1)、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、p-ACC兔多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p-ERK、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p-JNK、p38、p-p38抗體購自美國Bioworld公司；FGFR3和p-FGFR3抗體購自美國Affinity公司；過氧化物體增殖劑活化受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)抗體購自美國Abcam公司；β-actin鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；增強化學發光底物檢測試劑盒(ECL發光劑)購自美國Thermofisher公司。

1.1.3儀器 Olympus AU640全自動生化分析儀；日本Nikon 80i熒光正置顯微鏡；英國Teche PCR儀；北京六一儀器廠電泳儀、電轉儀；Gel Documentation system曝光系統和Chemi Scope series凝膠成像系統均購自Clinx科學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組 適應性飼養1周后，將SD大鼠隨機分為正常飲食組(CON，n=8)和高脂飲食組(HFD，n=32)，CON組給予標準飼料，HFD組給予高脂飲食，8周后，HFD組大鼠給予小劑量STZ(30 mg·kg-1)一次性腹腔注射，建立肥胖T2DM大鼠模型(體質量超過基礎飼料組平均體質量20%，取尾靜脈血，測空腹血糖>7.8 mmol·L-1，即為造模成功)，再隨機分為2組：假干預組(DM，腹腔注射生理鹽水)和利拉魯肽干預組(DM+LRG，腹腔注射利拉魯肽0.4 mg·kg-1·d-1，每天2次)，干預6 周。所有操作均遵守安徽醫科大學實驗動物倫理委員會要求。

1.2.2血清代謝指標和FGF21測定 所有大鼠禁食12 h后水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，分離血清(3 000 r·min-1，15 min)，分析血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST)，ELISA法測定血清FGF21水平。

1.2.3病理形態學觀察 取附睪脂肪組織，以10%的中性多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進行常規HE染色，在光鏡下觀察并拍照。

1.2.4免疫組化分析 石蠟包埋脂肪組織以4 μm連續切片，SABC法進行PPARγ、p-AMPK、p-ACC、p-ERK的免疫組化分析，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，使用PBS緩沖液代替一抗作為空白對照，光鏡下觀察并拍照。每張切片隨機選取10個視野，用生物圖像軟件計算各組免疫陽性細胞的平均光密度值(integral optical density, IOD )。

1.2.5RT-PCR RNAiso Reagent提取各組大鼠附睪脂肪組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，RT-PCR分析FGF21、FGFR3、LKB1、AMPK、ACC的mRNA表達，GAPDH作為內參照，應用Gel Documentation System曝光系統對目的基因和參照基因條帶進行定量分析。檢測的目的基因及引物序列見Tab 1。

Tab1 Primer sequences for target genes

1.2.6Western blot 取0.1 g附睪脂肪組織，RIPA裂解液制備勻漿，12 000 r·min-1、4℃離心15 min取上清抽提總蛋白并定量。以β-actin為內參照，Western blot法檢測FGF21、β-klotho、p-FGFR3、FGFR3、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK的蛋白表達，Chemi Scope series凝膠成像系統分析結果。

2 結果

2.1利拉魯肽對DM大鼠體質量的影響與CON組相比，DM組體質量明顯上升，與DM組相比，DM+LRG組的體質量明顯下降，表明利拉魯肽有降低DM大鼠體質量的作用，見Fig 1。

2.2利拉魯肽對DM大鼠血生化指標、血清FGF21水平的影響與CON組比較，DM組大鼠TC、TG、ALT、AST均明顯升高，DM+LRG組TC、TG與 DM組相比差異無統計學意義，ALT、AST水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，HDL-C明顯升高(P<0.01)，見Tab 2。與DM組相比，DM+LRG組血清FGF21水平明顯升高(Fig 2)。

2.3利拉魯肽對DM大鼠白色脂肪細胞大小的影響與CON組相比，DM組大鼠的WAT中脂肪細胞的體積明顯增大(P<0.01)；與DM組相比，DM+LRG組的WAT中脂肪細胞明顯變小(P<0.01)。對脂肪細胞大小進行測量的結果與上述描述一致，見Fig 3。

2.4利拉魯肽對DM大鼠白色脂肪組織mRNA表達的影響與CON組相比，DM組大鼠WAT中FGF21、FGFR3、AMPK、ACC基因的mRNA 表達較CON組增高，LKB1基因表達下降，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與DM組相比，DM+LRG組WAT中FGF21、FGFR3的mRNA表達繼續上升，而LKB1、AMPK、ACC的mRNA表達下降，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，見Fig 4。

Fig 1 Effect of liraglutide on body mass of

CON: Control diet group; DM: Type 2 diabetic mellitus group; DM+LRG: DM and liraglutide treatment group (0.4 mg·kg-1·d-1)

Fig 2 Effect of liraglutide on serum FGF21levels of obese DM n=8)

GroupTC/mmol·L-1TG/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1ALT/mmol·L-1AST/mmol·L-1CON1±0.360.39±0.141.08±0.2146.25±20.8592.75±26.91DM1.49±0.4#0.76±0.78#1.09±0.2593.33±36.12#101±23.98##DM+LRG1.501±0.03 0.56±0.231.38±0.12**70.95±15.88*70.95±12.73**

CON: control diet group;DM: type 2 diabetic mellitus group; DM+LRG: DM and liraglutide treatment (0.4 mg·kg-1·d-1) .#P<0.05,##P<0.01vsCON;*P<0.05,**P<0.01vsDM

Fig 3 Representative photomicrographs of adipose tissuesstained with haematoxylin and n=8)

A: Control diet group; B: Type 2 diabetic mellitus group; C: DM and liraglutide treatment (0.4 mg·kg-1·d-1); D: Quantification of adipocyte size.##P<0.01vsControl;**P<0.01vsDM

2.5利拉魯肽對DM大鼠白色脂肪組織蛋白表達的影響Fig 5免疫組化的結果顯示，與CON組相比，DM組大鼠的WAT中PPARγ、p-AMPK、p-ACC的蛋白表達水平均明顯降低，p-ERK蛋白表達水平明顯升高，且主要分布在胞質中；DM+LRG組大鼠WAT中PPARγ、p-AMPK、p-ACC的蛋白表達均明顯增加，p-ERK表達水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)。Western blot的結果顯示，與CON組相比，DM組大鼠WAT中FGF21、β-klotho、p-FGFR3 蛋白表達均減少(P<0.05)；與DM組相比，DM+LRG組白色脂肪組織中FGF21、β-klotho、p-FGFR3 蛋白表達均升高(P<0.05)(Fig 6A、6B)。在AMPK信號通路中上游p-LKB1、下游p-ACC均與p-AMPK的變化趨勢一致，表明該信號通路在DM狀態時下調，利拉魯肽治療后上調(Fig 6C、6D)。本研究還分析了MAPK 3條信號通路分子的磷酸化改變，結果發現它們均表現為先升后降的趨勢，即在DM時ERK、JNK、p38磷酸化增加，利拉魯肽治療后磷酸化水平減少(Fig 6E、6F)。

3 討論

Fig 4 Effect of liraglutide on mRNA expressionin adipose tissue of obese DM n=8)

#P<0.05,##P<0.01vsCON;*P<0.05,**P<0.01vsDM

傳統降糖藥物的治療過程中可能會出現體重增加、胰島功能減退及慢性并發癥等。LEAD(Liraglutide Effect and Action in Diabetes)研究表明，利拉魯肽可有效降低血糖、血壓、減輕體重，減少低血糖發生率。本研究結果表明，利拉魯肽能明顯降低T2DM大鼠的血脂水平和體重，其機制可能與誘導脂肪組織中FGF21 mRNA和蛋白水平的表達，進而激活AMPK和抑制MAPK通路有關，目前尚未見相關報道。

本實驗顯示，DM組大鼠的血脂和體重明顯增加，HDL-C明顯降低，DM+LRG組血脂和體質量明顯下降，表明利拉魯肽具有較好的改善高脂血癥和降低體質量的作用。利拉魯肽也能降低血清ALT、AST的水平，表明其還有一定的肝臟保護作用。

PPARγ可誘導WAT中FGF21的基因轉錄[7]。

#P<0.05vsControl；*P<0.05,**P<0.01vsDM

本研究證實，DM+LRG組WAT中PPARγ的表達升高，對應的血清FGF21水平與WAT中FGF21表達升高，表明利拉魯肽可能通過PPARγ誘導FGF21的表達，并成為血清FGF21的重要來源之一。

飲食誘導的肥胖小鼠靜脈連續輸注FGF21，能夠明顯降低體重和血糖的水平, 同時還會引起肝脂肪變性逆轉和血甘油三酯含量降低[8]。β-Klotho在WAT中含量豐富[2]，其選擇性表達決定了FGF21生物學功能的組織特異性[9]。由于過度表達和活化的FGFR3主要與成脂分化有關[10]，本研究中檢測了FGFR3和p-FGFR3，DM+LRG組WAT的β-Klotho、p-FGFR3表達均增加，可介導AMPK信號通路的激活。

AMPK是一種重要的細胞能量調節器，其上游激酶主要有LKB1和CaMKK[11]，其中LKB1廣泛分布于人體多種組織中；下游靶分子ACC的磷酸化水平可作為機體內AMPK活化狀態的標志物。本研究中DM+LRG組WAT中LKB1、AMPK、ACC磷酸化均增加，抑制脂肪酸及脂肪的合成，減少脂質沉積。RT-PCR和Western blot的結果不完全一致，推測可能與基因表達的轉錄后修飾有關。利拉魯肽可增加大鼠血管內皮細胞中的AMPK磷酸化，減少JNK的磷酸化[12]，與本研究結果一致。

MAPK途徑主要由ERK1/2、JNK、p38三條信號通路組成，在調控細胞增殖、分化和基因表達中有重要的作用。既往研究表明，利拉魯肽可通過上調ERK1/2的磷酸化、下調JNK和p38的磷酸化，減少缺血誘導的細胞凋亡，以發揮其神經保護作用[13]。利拉魯肽還能通過活化GLP-1受體、抑制ERK1/2，減少高糖誘導的血管平滑肌細胞的遷移、增殖和凋亡[14]。李婷婷等[15]報道，重組人FGF21作用于藥物誘導胰島素抵抗的HL-7702細胞時，可促進ERK1/2的磷酸化。本研究結果顯示，利拉魯肽通過誘導WAT中FGF21的表達、抑制MAPK 3條信號通路分子的磷酸化和活化，抑制脂肪細胞的增殖，推測可能與細胞類型和給藥方式的不同有關。

Fig 6 Effect of liraglutide on protein expression in adipose tissue of obese DM rats n=8)

A: Western blot of FGF21, β-klotho, p-FGFR3; B: Semi-quantitative analysis of protein expression of FGF21, β-klotho, p-FGFR3; C: Western blot of p-LKB1, p-AMPK, p-ACC; D: Semi-quantitative analysis of protein expression of p-LKB1, p-AMPK, p-ACC; E: Western blot of p-ERK, p-JNK, p-p38; F: Semi-quantitative analysis of protein expression of p-ERK, p-JNK, p-p38.#P<0.05，##P<0.01vsCON；*P<0.05,**P<0.01vsDM.

本研究從組織水平上闡明利拉魯肽誘導白色脂肪組織中FGF21的表達可能與激活AMPK和抑制MAPK信號通路有關，為深入了解利拉魯肽作為肥胖和T2DM的首選藥物、改善糖脂代謝提供理論依據。

(致謝：本實驗在安徽醫科大學基礎醫學院藥理學教研室、生物化學與分子生物學教研室和綜合實驗室完成，感謝實驗室老師和同學們給予的幫助和指導！)

[1] Saltiel A R, Olefsky J M. Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease [J].JClinInvest, 2017,127(1):1-4.

[2] Kharitonenkov A, Shiyanova T L, Koester A, et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator[J].JClinInvest, 2005,115(6): 1627-35.

[3] Chau M D, Gao J, Yang Q, et al. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2010,107(28): 12553-8.

[4] Yang M, Zhang L, Wang C, et al. Liraglutide increases FGF-21 activity and insulin sensitivity in high fat diet and adiponectin knockdown induced insulin resistance[J].PLoSOne, 2012,7(11): e48392.

[5] Nonogaki K, Hazama M, Satoh N. Liraglutide suppresses obesity and hyperglycemia associated with increases in hepatic fibroblast growth factor 21 production in KKAy mice[J].BiomedResInt, 2014,2014: 751930.

[6] Lynch L, Hogan A E, Duquette D, et al. iNKT cells induce FGF21 for thermogenesis and are required for maximal weight loss in GLP1 therapy [J].CellMetab, 2016,24(3):510-9.

[7] Muise E S, Azzolina B, Kuo D W, et al. Adipose fibroblast growth factor 21 is up-regulated by peroxisome proliferator-activated receptor gamma and altered metabolic states [J].MolPharmacol, 2008,74(2): 403-12.

[8] Xu J, Lloyd D J, Hale C, et al. Fibroblast growth factor 21 reverses hepatic steatosis, increases energy expenditure, and improves insulin sensitivity in diet-induced obese mice[J].Diabetes, 2009,58(1): 250-9.

[9] Adams A C, Coskun T, Rovira A R, et al. Fundamentals of FGF19 & FGF21 actioninvitroandinvivo[J].PLoSOne, 2012,7(5): e38438.

[10] Park J R, Lee H, Kim C H, et al. Functional characteristics of mesenchymal stem cells derived from the adipose tissue of a patient with achondroplasia[J].InVitroCellDevBiolAnim, 2016,52(5):545-54.

[11] Hardie D G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy [J].NatRevMolCellBiol, 2007,8(10):774-85.

[12] Li N, Zhao Y, Yue Y, et al. Liraglutide ameliorates palmitate-induced endothelial dysfunction through activating AMPK and reversing leptin resistance [J].BiochemBiophysResCommun, 2016,478(1):46-52.

[13] Zhu H, Zhang Y, Shi Z, et al. The neuroprotection of liraglutide against ischaemia-induced apoptosis through the activation of the PI3K/AKT and MAPK pathways [J].SciRep, 2016,6:26859.

[14] Shi L, Ji Y, Jiang X, et al. Liraglutide attenuates high glucose-induced abnormal cell migration, proliferation, and apoptosis of vascular smooth muscle cells by activating the GLP-1 receptor, and inhibiting ERK1/2 and PI3K/Akt signaling pathways[J].CardiovascDiabetol, 2015,14:18.

[15] 李婷婷，高麗昌，唐 祿，等. 成纖維細胞生長因子-21改善胰島素抵抗肝細胞對葡萄糖的吸收及機制[J]. 中國藥理學通報，2012，28(3): 366-71.

[15] Li T T, Gao L C, Tang L, et al. The effect of FGF-21 on the glucose uptakes and insulin resistance in cultured human liver cells[J].ChinPharmacolBull, 2012,28(3): 366-71.