黃芪多糖對抑郁大鼠海馬NF-κB信號通路的影響

王 煜，李承德,2，曲敬蓉，李 浩，陳博超，聶 克，毛淑梅

(1. 濰坊醫學院藥理學教研室，山東省重點應用藥理學實驗室，山東 濰坊 261053；2. 山東中醫藥大學基礎醫學院，山東 濟南 250355；3. 廣東藥科大學中藥學院中藥藥理學教研室，廣東 廣州 510006)

資料顯示，抑郁發病率逐年增高，目前全球約有15%的人受抑郁困擾[1]。海馬在情緒調節中發揮重要作用，研究表明，海馬NF-κB信號通路過度激活與抑郁的發生、發展密切相關。已證實，調節過度激活的海馬NF-κB信號通路可減輕抑郁動物模型的抑郁行為[2]。黃芪是一種具有多種藥理活性的中藥，黃芪及其提取物在抑郁的治療中應用已久[3-4]。黃芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)是黃芪的提取物之一，具有神經保護、抗炎、抗氧化等多種活性。研究顯示，APS對哮喘、糖尿病等多種動物模型的NF-κB通路活性具有抑制作用[5]。但APS是否具有抗抑郁作用？對抑郁機體海馬NF-κB信號通路活性有何影響？均未見報道。本研究擬就上述問題進行探索，觀察APS對大鼠抑郁行為的影響，并探索其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 ♂Wistar大鼠40只，體質量(200±20)g，購自魯抗集團，動物合格證號: SCXK魯20130001。

1.1.2藥品與試劑 APS(惠州市東方植物保健科技有限公司)；NF-κB p65酶聯免疫試劑盒、p-NF-κB p65、p-IκBα一抗(美國Cell Signaling公司)；羊抗兔IgG(武漢博士德公司)；TranAMTMNF-κB p65轉錄因子分析試劑盒(美國Active Motif公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯免疫試劑盒(武漢華美公司)。

1.1.3儀器 酶標儀(美國Molecular Devices公司)；Morris水迷宮(上海軟隆科技發展有限公司)；電泳儀、轉印儀(美國Bio-Rad Laboratories公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備及藥物干預 大鼠隨機分為正常組、抑郁組、APS高、低劑量組，每組10只。抑郁組、APS高、低劑量組大鼠采用經典的慢性輕度不可預見性應激法(chronic unpredictable mild stress, CUMS)誘導抑郁行為。應激因素包括：熱刺激(45℃)，冷水游泳(4℃，5 min)，飲水剝奪(48 h)，飲食剝奪(48 h)，夾尾(180 s)，軀體束縛(1 h)，電擊足底(電壓30 V，120 s，每電擊15 s間歇5 s)，晝夜顛倒，閃光刺激，傾斜鼠籠、潮濕墊料、單籠飼養等居住環境改變，噪音干擾(2 h)等，共刺激4周。正常組不予以應激刺激。APS高、低劑量組大鼠在接受CUMS刺激的同時，分別給予APS 400、200 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，每日1次，連續用藥4周；正常組、抑郁組大鼠給予相同體積的生理鹽水。

1.2.2糖水攝取實驗 根據文獻[6]，在測試前，先給予大鼠1%蔗糖水24 h，訓練動物適應含糖的飲水。測試過程：大鼠禁水24 h后，單籠飼養，并給予每只大鼠兩瓶外觀相同的飲水，一瓶為純水，一瓶為1%蔗糖水，留置12 h，計算每瓶液體的攝取量，計算糖水攝取量占總液體攝取量的百分比。

1.2.3強迫游泳實驗 根據文獻[6]，將大鼠置于游泳設備內，留置5 min，將大鼠游泳活動錄像，并計數大鼠在水面靜止不動時間。測試前1 d，將大鼠置于游泳設備內15 min，訓練大鼠適應游泳測試容器。

1.2.4曠場實驗 根據文獻[6]，將大鼠置于敞箱中心格內(敞箱大小為100 cm×100 cm×80 cm，內壁涂為黑色，底面均分為25格)，大鼠在敞箱內自由活動5 min，錄像并計數大鼠水平活動及垂直活動得分。測試每只大鼠前，均用乙醇徹底清潔敞箱。

1.2.5Western blot分析 處死大鼠，取新鮮海馬組織，提取總蛋白，上樣40 μg，電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜，室溫下用10%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，一抗(p-NF-κB-p65、p-IκBα稀釋度為1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST漂洗10 min×3次，二抗(1 ∶10 000)37℃孵育2 h，漂洗3次，顯影，采用化學發光成像系統進行檢測分析，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度/β-actin條帶灰度。

1.2.6NF-κB p65 DNA結合活性檢測 取部分海馬組織，提取核蛋白，利用TranAMTMNF-κB p65轉錄因子分析試劑盒，檢測NF-κB p65 DNA結合活性。

1.2.7ELISA檢測 將部分海馬組織勻漿，離心后取上清液凍存。采用ELISA法檢測海馬組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結果

2.1APS對大鼠糖水攝取量的影響如Tab 1所示，與正常組比較，抑郁組大鼠糖水攝取量明顯減少(P<0.05)。與抑郁組比較，APS低、高劑量組大鼠糖水攝取量均明顯增增加(P<0.05)，且高劑量組大鼠糖水攝取量高于低劑量組(P<0.05)。

2.2APS對大鼠游泳靜止時間的影響Tab 1結果顯示，強迫游泳實驗中，與正常組比較，抑郁組大鼠靜止不動時間明顯延長(P<0.05)。APS低、高劑量組大鼠靜止不動時間均較抑郁組明顯縮短(P<0.05)，且高劑量組大鼠靜止不動時間短于低劑量組(P<0.05)。

2.3APS對大鼠自主活動的影響曠場實驗中(Tab 1)，與正常組比較，抑郁組大鼠水平活動及垂直活動得分均明顯減少(P<0.05)。APS低、高劑量組大鼠自主活動與抑郁組無明顯區別(P>0.05)。

2.4APS對海馬NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IκBα表達的影響如Tab 2、Fig 1所示，與正常組比較，抑郁組大鼠海馬NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平明顯升高(P<0.05)。APS低、高劑量組大鼠海馬上述物質水平均明顯低于抑郁組(P<0.05)，且高劑量組水平低于低劑量組(P<0.05)。

2.5APS對海馬NF-κBp65DNA結合活性的影響如Fig 2所示，與正常組比較，抑郁組大鼠NF-κB p65 DNA結合活性明顯升高(P<0.05)。APS低、高劑量組大鼠NF-κB p65 DNA結合活性均明顯低于抑郁組(P<0.05)，且高劑量組NF-κB p65 DNA結合活性低于低劑量組(P<0.05)。

Tab 1 Effects of APS on behaviors of n=10)

*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs model; △P<0.05 vs APS 200 mg·kg-1

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsAPS 200 mg·kg-1

Fig 1 Effects of APS on levels of p-NF-κB p65

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAPS 200 mg·kg-1group

2.6APS對海馬TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響Tab 2結果顯示，與正常組比較，抑郁組大鼠海馬TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高(P<0.05)。與抑郁組比較，APS低、高劑量組大鼠海馬TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(P<0.05)，且高劑量組上述因子的水平較低劑量組進一步下降(P<0.05)。

3 討論

目前常用的治療抑郁的藥物以西藥為主，包括單胺氧化酶抑制劑、三環類抗抑郁藥、雜環類抗抑郁藥等，其中多數藥物具有較為突出的不良反應。近年，國內外學者在傳統藥物及其提取物治療抑郁癥方面進行了大量研究，發現多種提取物具有抗抑郁作用[7]，為抗抑郁藥的發現開辟了新的途徑。黃芪及其提取物在抑郁的治療中應用已久[3-4]。APS是黃芪的提取物之一，具有抗炎、神經保護等多種藥理活性，但其是否具有抗抑郁活性未見報道。

Fig 2 Effects of APS on NF-κB p65DNA binding activity n=10)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAPS 200 mg·kg-1group

本研究采用CUMS法制備抑郁大鼠模型，并給予APS治療，治療后對動物行為學進行了評價。強迫游泳實驗被廣泛用于抗抑郁藥物的療效評價，其中靜止不動時間代表抑郁動物的絕望程度[6]。本研究結果顯示，CUMS明顯延長了強迫游泳實驗中大鼠的靜止不動時間，而APS明顯縮短了抑郁大鼠的靜止不動時間，說明APS對大鼠具有抗抑郁作用。快感缺乏是抑郁的另一項重要表現，糖水消耗實驗被廣泛用于評價抑郁動物的快感缺乏程度[6]。本研究結果顯示，CUMS明顯減少了大鼠的糖水攝取量，而APS明顯增加了抑郁大鼠的糖水攝取量，該實驗結果進一步驗證了APS具有抗抑郁活性。文獻顯示，抑郁動物的自主活動情況會影響在抑郁評價實驗中的行為，從而引起實驗誤差[8]。為排除APS可能通過改變大鼠的自主活動而干擾抗抑郁行為的評價結果，本文通過曠場實驗觀察了APS對大鼠自主活動的影響。結果顯示，APS未改變大鼠的自主活動，該結果表明APS治療后，大鼠行為學的改善的確源于APS的抗抑郁作用，而未受大鼠自主活動影響。與本研究結果類似，Liu等[9]研究顯示多種藥物在發揮抗抑郁作用時，對動物的自主活動無明顯影響。

目前抑郁癥發病機制尚未完全明了，大量研究顯示，轉錄因子NF-κB參與了抑郁的發生與發展[2]。NF-κB包括Rel、p65、RelB、p50、p52等5個亞單位，其中p65在與DNA結合、轉錄活化中發揮重要作用。在未激活狀態時，NF-κB與IκB結合形成復合體，IκB限制了NF-κB向細胞核移位。在外界某些信號的刺激下，IκB發生磷酸化反應，IκB轉變為磷酸化IκB(p-IκB)，從而導致IκB失活，解除了對NF-κB的抑制，NF-κB進入核內與特異的κB序列結合，誘導其調控的基因進行轉錄。NF-κB在調節炎癥反應方面發揮重要作用，近年研究表明抑郁的發生與炎癥反應密切相關。大量文獻顯示，抑郁機體NF-κB信號通路被過度激活，而利用藥物抑制NF-κB的過度激活，可減輕抑郁模型動物的抑郁行為[2,10]。NF-κB對抑郁的影響可能與其引起的炎癥反應，干擾了中樞情緒調節有關。海馬在情緒調節中發揮重要作用，本研究顯示，CUMS明顯升高了大鼠海馬NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平，并增加了NF-κB p65 DNA結合活性。其他研究也發現，CUMS可激活動物NF-κB信號活性[11]，與本研究結果一致。APS明顯降低了抑郁大鼠海馬NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平，并降低了其NF-κB p65 DNA結合活性，表明APS可明顯抑制CUMS引起的NF-κB信號過度激活。由此推斷，APS的抗抑郁作用可能與抑制大鼠海馬NF-κB活性有關。與本文APS對NF-κB的影響類似，另有文獻顯示，APS可抑制哮喘、結腸炎動物模型體內NF-κB信號通路，從而發揮治療作用[5,12]。

NF-κB對機體的影響是通過其調控的下游效應分子實現的[13]。TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子是NF-κB信號通路的重要下游分子，在炎癥反應等病理過程中發揮重要作用。研究表明，抑郁患者及抑郁動物模型上述細胞因子均較正常水平明顯升高。TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高與抑郁發展的關系已被大量文獻證實，許多以降低上述因子水平為目標的治療方案，均顯示了良好的抗抑郁作用[14]。本研究結果顯示，CUMS明顯升高了大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，這與既往文獻報道一致。經APS干預后，與對NF-κB的作用一致，APS明顯降低了抑郁大鼠海馬TNF-α、IL-1β、IL-6水平，這進一步驗證了APS對NF-κB信號通路具有抑制作用。結合文獻及本研究結果，推論APS的抗抑郁作用可能與抑制抑郁大鼠海馬的NF-κB下游細胞因子有關。除本研究外，APS的抗炎作用已被大量報道，資料顯示，APS可明顯降低哮喘、心肌肥厚等動物模型的多種細胞因子水平，從而發揮治療作用[5,15]。

綜上所述，APS可減輕CMUS誘發的大鼠抑郁行為，其抗抑郁作用可能與抑制CUMS誘發的NF-κB激活信號通路過度激活有關。

[致謝：本研究在濰坊醫學院應用藥理學實驗室(山東省重點實驗室)完成。]

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