外泌體對過表達GATA-4小鼠骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化能力促進作用的研究

賀繼剛，韓金秀，李貝貝，李宏遠，嚴丹，任靖宇*

本研究背景：

冠心病位居世界人口死亡原因首位。目前國內外對冠心病的治療主要分為：外科治療、內科治療及細胞治療。細胞治療中應用最為成熟的是骨髓間充質干細胞（BMSCs），雖然已有大量文獻證實BMSCs可以改善心肌梗死后心功能。但干細胞臨床應用尚不成熟，而GATA-4是調控心臟基因表達的重要轉錄因子。目前已經證明過表達GATA-4的BMSCs可以通過促進BMSCs向心肌細胞分化，從而有效改善心肌梗死后心功能。然而轉染基因干細胞的致瘤性使干細胞的臨床應用前景遙遙無期。有什么可以讓細胞修復的優勢凸顯，而同時又可以規避其風險呢？本研究將目光聚焦于細胞分泌的外泌體。外泌體是從細胞上產生的鱗片狀脫落的囊泡，具有多種生物學功能，可以使細胞在不需要直接接觸下完成細胞間生物信號的傳導，其在細胞保護、免疫、疾病診斷等方面成為目前研究的熱點。基于此，本研究采用過表達GATA-4的小鼠BMSCs分泌的外泌體，證明其可以充分有效促進BMSCs向心肌細胞分化。

冠心病引起的心肌梗死（即心肌損傷）已成為目前世界范圍內的頭號“殺手”。據世界衛生組織（WHO）統計：2000—2012年冠心病位居世界人口死亡原因首位［1-2］。目前干細胞治療成為研究熱點，尤其是骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），雖然已有大量文獻證實BMSCs可以改善心肌梗死后心功能［3］。但亦有更多的學者提出，干細胞應用臨床尚不成熟，主要原因在于BMSCs安全性一直受到廣泛懷疑［4］。本課題組前期研究已經證明過表達GATA-4可以有效促進BMSCs向心肌細胞分化［5］。在此研究基礎上，本課題組將目光進一步聚焦于細胞分泌的外泌體。外泌體具有多種生物學功能，可以使細胞在不需要直接接觸下完成細胞間生物信號轉導。本研究利用慢病毒攜帶GATA-4轉染小鼠BMSCs并提取分泌的外泌體，通過與BMSCs共培養后采用免疫熒光、反轉錄聚合酶鏈式反應（qPCR）證明過表達GATA-4的小鼠BMSCs分泌的外泌體可以有效促進BMSCs向心肌細胞分化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2016年1—6月選取健康4周齡SPF級C57BL/6小鼠10只，均為雄性，體質量20～25 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK（川）2015-030。

1.2 主要試劑和儀器 C57BL/6小鼠BMSCs完全培養基（低糖培養基，含10%胎牛血清）購自美國Cyagen Biosciences公司，肌鈣蛋白T（cTnT）、α肌動蛋白（α-actin）、肌間線蛋白（Desmin）購自英國Abcam公司，Connexin 43購自美國Proteintech Group公司，CD29、CD44、CD11b、干細胞抗原 1（Sca-1）抗體購自美國BioLegend公司，ExoQuick-TC購自美國System Biosciences公司，CD11bMicroBeads購于美國Miltenyi公司，熒光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon90i。

1.3 小鼠BMSCs的分離、培養及鑒定 取C57BL/6小鼠，脫頸處死，75%乙醇溶液浸泡15 min，取出股骨和脛骨，再以75%乙醇溶液浸泡1～2 min，置于0.9%氯化鈉溶液中，兩端剪斷暴露骨髓腔。用1 ml注射器將0.9%氯化鈉溶液沖出骨髓，收集致無菌離心管中，以1 500×g離心10 min后，以含10%胎牛血清的C57BL/6小鼠BMSCs完全培養基重懸細胞制備細胞懸液，以2×106/cm2密度接種至25 cm2塑料培養瓶，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。并標記為原代（passage 0，P0）。胰酶消化傳代至第3代時采用CD11b的磁珠負選，去除造血干祖細胞。繼續傳代至第7代。取生長至第7代的BMSCs，待細胞融合達80%～90%時，制備單細胞懸液，采用流式細胞檢測CD29、CD44、CD11b、SCA-1〔PE-CD29單抗 5 μl按 1∶20 稀釋至 100 μl、PE-CD11b單 抗 5 μl按 1∶40 稀 釋 至 100 μl、PE/Cy5-CD445 μl按1∶20稀釋至100 μl、異硫氰酸熒光素（FITC） antimouse SCA-1 5 μl按 1∶20 稀釋至 100 μl〕。

1.4 慢病毒載體及基因開啟技術構建過表達GATA-4-BMSCs 將已構建成功的GATA-4基因插入慢病毒包裝質粒GV308中，構建GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質粒。將構建成功的GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質粒轉染入小鼠BMSCs并加入基因開啟劑多西環素（DOX）。轉染成功后利用qPCR方法檢測轉染72 h過表達GATA-4組及陰性對照組GATA-4 mRNA表達水平，具體過程參考文獻［5］。

1.5 外泌體提取及檢測 按照ExoQuick-TC說明書提取外泌體：收集培養基，3 000×g離心15 min，以去除細胞及細胞碎片；并將上清液轉移至無菌管中，加入適當體積的ExoQuick-TC 外泌體沉淀液（見說明書）。反復顛倒或輕彈試管使其混勻。冷藏（4 ℃）過夜。保溫培養過程中無需旋轉試管。 以1 500×g離心30 min ExoQuick-TC體液混合液。外泌體沉淀位于試管底部，呈淺褐色或白色。吸出上清液，1 500×g離心5 min以沉降殘余的ExoQuick-TC溶液。小心地吸干所有液體，不破壞已沉淀的外泌體。并利用電鏡檢測提取外泌體形態。

1.6 免疫熒光定性檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表 達 將GATA-4-BMSCs-外 泌 體 與BMSCs共同培養（A組），空載體-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養（B組），BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養（C組），BMSCs單獨培養（D組）及小鼠心肌細胞單獨培養（E組）72 h，將共同培養及單獨培養完成的細胞，加合適濃度的一抗（cTnT 20 μg/ml，α-actin 50 μg/ml，Connexin 43 30 μg/ml，Desmin 0.6 μg/ml）。再加入合適濃度的熒光標記二抗（0.5 mg/ml，稀釋比例1∶1 000），采用熒光共聚焦顯微鏡檢測細胞cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達情況。

1.7 qPCR法定量檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表 達 將GATA-4-BMSCs-外 泌 體 與BMSCs共同培養（A組），空載體-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養（B組），BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養（C組），BMSCs單獨培養（D組）及小鼠心肌細胞單獨培養（E組）72 h，應用beacon designer 7.90設 計qPCR引 物，cTnT上 游 引 物：5′-AATGAAGACCAACTGAGA-3′，下游引物：5′-TATTTCTGCTGCTTGAAC-3′；α-actin上游引物：5′-GAGTAATGGTTGGAATGG-3′，下游引物：5′-GTTCTATCGGATACTTCAG-3′；Connexin 43上游引物：5′-TCAAGAAGTTCAAGTATGG-3′，下游引物：5′-ATGCTGATGATGTAGGTT-3′；Desmin上游引物：5′-CGTGACAACCTGATAGAC-3′，下游引物：5′-TTCTCTGCTTCTTCTCTTAG-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性 10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，95 ℃延伸15 s，共40～45個循環。完成總RNA提取，反轉錄為cDNA，完成目的基因擴增。收集信息，做Ct值分析（計算與統計分析軟件 LERTPA-V 1.0）。實驗重復3次。

1.8 統計學方法 采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠BMSCs流式細胞儀鑒定結果 小鼠BMSCs CD29表達率為98.0%、CD44表達率為100.0%、CD11b表達率為0.1%、Sca-1表達率為99.5%。

2.2 轉染72 h后GATA-4 mRNA表達水平 轉染72 h后，過表達GATA-4組GATA-4 mRNA表達水平為（78.17±1.32），陰性對照組GATA-4 mRNA表達水平為（0.57±0.34），過表達GATA-4組GATA-4 mRNA表達水平較陰性對照組明顯升高，差異有統計學意義（t=2.576，P<0.05）。

2.3 外泌體 外泌體電鏡圖片顯示，大小介于40～100 nm顆粒成團聚集，為BMSCs分泌出的外泌體（見圖1，本文彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章）。

圖1 ExoQuick-TC法提取外泌體電鏡圖片（×5 000）Figure 1 Exosomes extracted by ExoQuick-TC

2.4 免疫熒光定性檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表 達 A組 GATA-4-BMSCs-外 泌 體 與BMSCs共同培養72 h可見細胞核被DAPI染為藍色，表達出綠色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin；B、C、D組可見細胞核被DAPI染為藍色，沒有表達出綠色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin；E組可見細胞核被DAPI染為藍色，表達出綠色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin（見圖2）。

2.5 qPCR法定量檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達 5組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其中E組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達水平較A組升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；A組和E組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達水平較B組、C組和D組升高，差異均有統計學意義（P<0.05，見表1）。

3 討論

2003年美國食品藥品監督管理局（FDA）率先批準BMSCs用于心肌梗死的治療。多年來，科學界一直研究采用無細胞方法治療心肌梗死。前期為了使BMSCs更好地向心肌細胞分化，本課題組采用慢病毒轉染BMSCs使其可以過表達 GATA-4［5］。

GATA-4在心臟發育的早期起重要作用，抑制其表達，可以阻斷P19畸胎瘤細胞向心肌細胞分化，強表達則增強心肌細胞分化［6］。

圖2 免疫熒光定性檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達（×400）Figure 2 Expressions of cTnT，α-actin，Connexin 43 and Desmin in groups A，B，C，D and E stained by immunofluorescence

表 1 各組 cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達水平比較（s，n=3）Table 1 Comparison of expressions of cTnT，α-actin，Connexin 43 and Desmin in groups A，B，C，D and E

表 1 各組 cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達水平比較（s，n=3）Table 1 Comparison of expressions of cTnT，α-actin，Connexin 43 and Desmin in groups A，B，C，D and E

注：cTnT=肌鈣蛋白T，α-actin=α肌動蛋白，Desmin=肌間線蛋白；與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05

組別 cTnT α-actin Connexin 43 Desmin A 組 3.37±0.20 4.65±0.20 4.55±0.22 4.45±0.39 B 組 1.37±0.30a 1.18±0.09a 1.09±0.14a 1.50±0.32a C 組 1.29±0.29a 1.49±0.20a 1.63±0.37a 1.42±0.18a D組 1.00a 1.00a 1.00a 1.00a E 組 5.00±0.00abcd 5.28±0.33abcd 5.69±0.21abcd 5.09±0.05abcd F值 5.564 7.033 6.328 5.794 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

外泌體是小的膜性囊泡，從20世紀90年代起受到極大關注［7-8］。外泌體于1981年首先提出，是從細胞上產生的鱗片狀脫落的囊泡，具有胞外酶的活性［9］。外泌體可能扮演細胞與細胞之間的信號作用，可以遠距離運輸并將所攜帶物質釋放入細胞影響受體細胞的處理過程。例如，RNA從一個細胞穿梭到另一個細胞，被稱為“外泌體載體RNA”，能夠影響受體細胞的蛋白質產生［10-11］。外泌體不但有免疫調節作用，還有減輕心肌缺血/再灌注損傷的效果。TIMMERS等［12］報道，為了更好地理解外泌體的心肌保護作用，將間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）培養基采用濾膜將其內部成分系統性的分為各個等級大小，表明具有心肌保護成分為＞1 000 kPa。即心肌保護是由直徑為50～100 nm的囊泡所介導的［12］。MSCs營養改善心肌缺血已有大量研究，據TANG等［13］報道MSCs進入缺血心臟，可以減少組織反應，增加血管生成及減少細胞的凋亡，相比用MSCs轉化，其旁分泌可以更好地解釋這些效果。迄今為止，總是將MSCs的旁分泌局限于細胞因子、化學因子及介導于細胞間信號的生長因子。而外泌體的出現從根本上改變了當前對MSCs旁分泌的理解。

本實驗正是在上述研究基礎上采用GATA-4-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養，空載體-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養，BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養，BMSCs單獨培養及小鼠心肌細胞單獨培養72 h后，采用免疫熒光檢測心肌特異性抗原cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達。并進一步利用qPCR的方法，定量檢測上述心肌特異性抗原的表達。發現GATA-4-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達水平低于小鼠心肌細胞單獨培養，但較其他增多。證實過表達GATA-4-BMSCs分泌的外泌體可以有效促進BMSCs向心肌細胞分化。

綜上所述，過表達GATA-4的BMSCs分泌的外泌體可以更為有效地促進BMSCs向心肌細胞分化。

本文無利益沖突。

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