沉默PHLDA1基因表達抑制胃癌細胞增殖

丁方方， 申紅星， 王華， 邵世和

(1. 江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013； 2. 安徽醫科大學第一附屬醫院生殖中心， 安徽 合肥 230032)

胃癌死亡率居世界癌癥第3位[1-2]。由于缺乏特定的早期癥狀，大多數胃癌患者確診時常已屬晚期，5年生存率低于20%[3]。盡管胃癌在手術、化療、放療和靶向治療等方面取得了顯著進展，但是患者預后仍未得到顯著改善[4]。普列克底物蛋白同源樣結構域家族A成員1蛋白(pleckstrin homology-like domain family A member 1, PHLDA1)是潛在的轉錄因子，為Fas(CD95)表達、活化和誘導小鼠T細胞雜交瘤細胞的凋亡所需，編碼一類進化高度保守的pleckstrin同源性相關蛋白家族[5-7]。PHLDA1在多種腫瘤中呈異常表達[7]：例如，在黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]、口腔癌[10]及胃腺癌[11]中呈低表達，而在結腸癌和腸腺癌中呈高表達，并且結腸癌細胞中，PHLDA1敲低可抑制非貼壁依賴性細胞的生長且減少其遷移[12-13]。研究表明，PHLDA1參與調節細胞的凋亡和增殖[14]。關于PHLDA1在胃癌中的作用及調控機制尚不清楚，本研究通過PHLDA1基因干擾技術觀察PHLDA1敲減對胃癌細胞增殖的影響，旨在探討PHLDA1在胃癌發病機制中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Trizol購自北京全式金生物技術有限公司；qRT-PCR試劑盒和反轉錄試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細胞蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒以及CCK8試劑均購自碧云天生物科技有限公司；靶向敲減PHLDA1基因的siRNA和對照亂序RNA序列均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；PVDF膜(0.45 μm)購買自密理博(中國)有限公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz公司)；GAPDH一抗(CST公司)；PHLDA1抗體(Abcam公司)；其他抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司；qRT-PCR引物合成于上海桑尼生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen公司)。

1.2 細胞培養

胃癌細胞系MGC-803、BGC-823、MKN- 45、SGC-7901和HGC-27均由本實驗室培養凍存，均培養于含10%胎牛血清和青、鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中，置于37 ℃、100%濕度、5%CO2的孵育箱中培養。

1.3 蛋白質印跡檢測PHLDA1蛋白的表達

收集“1.2”中5種細胞沉淀，用含PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，4 ℃，13 500 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA蛋白質測定法測量蛋白濃度；10%SDS-PAGE分離等量的總蛋白(300 ng)并轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜；洗膜；HRP標記羊抗兔抗體室溫下孵育1 h；洗膜；使用ECL增強化學發光試劑檢測特異性條帶。采用Image J(https:∥imagej.nih.gov/ij/)軟件對譜帶的相對密度進行量化。所有實驗重復至少3次。其中，抗體GAPDH作為內參。

1.4 qRT-PCR檢測各胃癌細胞中PHLDA1 mRNA水平

根據說明書，用Trizol提取MGC-803、BGC-823、MKN-45、SGC-7901以及HGC-27各細胞株的總RNA。分別取各細胞總RNA 500 ng，反轉錄合成cDNA。

以各胃癌細胞系反轉錄合成的cDNA為模板，按照說明書進行操作，利用ABI Step One Plus實時PCR系統進行qRT-PCR。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，80～85 ℃收集熒光，40個循環；65～95 ℃生成熔解曲線，Roto-Gene Melt Curve Analysis軟件進行熔解曲線分析。每個樣品檢測重復3次，求得平均Ct值。以GAPDH內參基因作空白對照，按照2-ΔΔCt公式計算出mRNA的相對表達量，其中ΔΔCt=(Ct實驗組-Ct對照組)mRNA-(Ct實驗組-Ct對照組)GAPDH。所用的引物序列如下，GAPDH：上游5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，下游5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′；PHLDA1：上游5′-CTCCAACATGAAGACCGTG-3′，下游5′-GCCTGACGATTCTTGTACT-3′。

1.5 MGC-803細胞的轉染分組及凋亡相關蛋白的檢測

制備MGC-803細胞懸液，調整細胞密度約1.0×105個/mL，接種于6孔板中，每孔2 mL；培養細胞18～24 h，待細胞匯合度達到約60%時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑的說明書進行轉染；將細胞分為2組，對照組細胞轉染亂序RNA(siR-NC)，干擾組細胞轉染靶向干擾的PHLDA1 siRNA(siR-PHLDA1)。siRNA序列如下：siR-NC正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′； siR-PHLDA正義鏈5′-AAGAAUGUGCCAAGUGUAAGA-3′，反義鏈5′-UCUUACACUUGGCACAUUCUU-3′。

采用蛋白質印跡法檢測2組細胞PHLDA1和Bax、Caspase-8、Cleaved-caspase-8、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Caspase-9和Cleaved-caspase-9等凋亡相關蛋白的表達，具體方法同“1.3”；其中，抗體GAPDH作為內參，抗體稀釋比均為1 ∶1 000。

1.6 CCK-8細胞增殖實驗檢測MGC-803細胞的增殖能力

轉染后48 h，消化細胞，接種于含無血清培養基的96孔板中(5×103/孔)，分別設置對照組和干擾組，共5對，每對設置3個復孔；細胞混勻后于孵育箱培養4～6 h；待細胞貼壁后，將培養基替換成含血清的培養基；取1對對照組和干擾組細胞，加入預先混勻的培養基和CCK8試劑混合液(CCK8試劑10 μL/孔)，繼續培養1～4 h；用酶標儀讀取細胞的光密度值，連續監測5 d；最終以第1次數值為基線繪制細胞的增殖曲線。

1.7 平板克隆實驗檢測細胞的克隆形成能力

取轉染48 h后的胃癌細胞，消化、計數，接種于含完全培養基的6孔板中(800個/孔)，分別設置對照組和干擾組，并設置3個復孔；細胞混勻后繼續培養7～14 d，每隔3 d更換1次培養基；待細胞形成明顯的肉眼可見的細胞團時，棄培養基，PBS沖洗，4%低聚甲醛室溫固定20 min；結晶紫室溫染色30 min；PBS沖洗，室溫晾干，計數分析。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各胃癌細胞株中PHLDA1 mRNA和蛋白的表達水平

結果顯示，MGC-803和MKN-45細胞株中PHLDA1 mRNA表達量明顯高于其他胃癌細胞株；MGC-803胃癌細胞中PHLDA1蛋白表達量明顯高于其他細胞株。見圖1。因此，本研究選取MGC-803細胞進行后續實驗。

圖1 各胃癌細胞系中PHLDA1蛋白和mRNA的表達水平

2.2 PHLDA1 siRNA轉染后干擾效率的驗證

蛋白質印跡結果顯示，與siR-NC組相比，siR-PHLDA1組中PHLDA1表達量顯著降低(P<0.01)，見圖2。由此證實，靶向siRNA PHLDA1轉染成功。

2.3 轉染PHLDA1 siRNA抑制細胞增殖

CCK8結果顯示，細胞培養至第2天時，siR-PHLDA1組MGC-803細胞增殖速率較對照組明顯減慢(t=2.784,P<0.05)。平板克隆實驗結果顯示，與siR-NC組相比，siR-PHLDA1組細胞增殖形成的克隆數量明顯減少，且單個細胞形成的克隆直徑明顯減小(t=0.008,P<0.05)。見圖3。

2.4 PHLDA1干擾后細胞凋亡相關蛋白的表達

蛋白質印跡結果顯示，與對照組相比，干擾組MGC-803細胞中Cleaved-caspase-8，Cleaved-caspase-3，Caspase-9,Cleaved-caspase-9蛋白表達明顯增加(P<0.05或<0.01)，Bax，Caspase-8和Caspase-3表達差異無統計學意義。見圖4。

圖2 蛋白質印跡檢測MGC-803細胞中PHLDA1蛋白的表達

a:P<0.05,與siR-NC組比較；A：CCK8實驗檢測細胞的增殖速度；B：克隆形成實驗檢測單個細胞的克隆形成

a: P<0.05，b：P<0.01；1：Bax；2：Caspase-8；3：Cleaved-caspase-8；4：Caspase-9；5：Cleaved-caspase-9；6：Caspase-3；7：Cleaved-caspase-3

3 討論

研究表明，PHLDA1可能作為一種轉錄激活因子，調控細胞的凋亡、增殖、分化和遷移，從而影響細胞存活和各種癌癥的發生，包括黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌、結腸癌、腸癌等[15]。本研究表明PHLDA1在胃癌細胞中呈不同程度高表達，且在MGC-803細胞表達量最高。然而，在胃癌細胞中PHLDA1于蛋白水平和mRNA水平的表達并不完全一致，這可能是由于基因的表達分為轉錄和翻譯兩個層面，即mRNA水平和蛋白水平。首先，真核基因表達的轉錄和翻譯存在時間和空間間隔，且轉錄后加工涉及轉錄產物的降解、翻譯、翻譯后加工及修飾幾個層面；其次，由于檢測的時間點不同，可能在蛋白達到峰值的時候mRNA已經降解或者在mRNA達到峰值的時候蛋白量還在增加中。

癌細胞的顯著特征是具有無限增殖的能力。研究報道，PHLDA1是人類小腸和大腸中的上皮干細胞標志物，促進結腸癌細胞的遷移和增殖[12]。本研究結果顯示PHLDA1干擾抑制了MGC-803細胞的增殖，從而可能延緩腫瘤細胞的生長繁殖。

腫瘤細胞凋亡異常增加會一定程度抑制腫瘤的進展[16]。細胞凋亡過程涉及半胱天冬酶(caspases)和Bcl-2家族成員的激活。Bax屬Bcl-2家族，是一種促凋亡蛋白[17]；其導致細胞色素C從線粒體釋放至細胞質并激活半胱氨酸蛋白酶級聯反應，引發細胞凋亡[18]。Caspase-2，-8，-9，10是凋亡的啟動子蛋白，Caspase-3，-6，-7是凋亡的執行子蛋白[19]。Mondal等[20]研究發現，磺基石蠟通過促進胃癌AGS細胞中Bax、Caspase-3及Caspase-8等蛋白表達，進而誘導細胞凋亡。另一項研究發現，在胃癌SGC-7901細胞中，迷佐酸通過激活Caspase-3，-8，-9蛋白誘導細胞凋亡[21]。此外，在口腔癌細胞中，PHLDA1 siRNA干擾可促進Caspase-3活化誘導細胞凋亡[22]。在NIH-3T3細胞中，PHLDA1同樣發揮著抗凋亡作用[23]。本研究結果表明，PHLDA1干擾上調了Cleaved-caspase-8、Caspase-9、Cleaved-caspase-9以及Cleaved-caspase-3的表達，由此推測，這些蛋白的異常增加可能促進胃癌細胞的凋亡。由于本文未檢測細胞的凋亡，有待進一步研究。

簡而言之，本研究結果顯示PHLDA1的敲減抑制胃癌細胞增殖，提示PHLDA1可能促進胃癌的發生。

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