試論丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法化學發光檢測的應用

陳贏 於瑞敏

摘 要：目的：研究丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法化學發光檢測的應用。方法：采集250份血液篩選結果為陰性標本以及250例質控血液樣本，分別對其應用雙抗原夾心法進行丙型肝炎病毒抗體檢測，并對結果進行統計分析。結果：本組208例HCV抗體陽性樣本中，一共檢出206例，敏感性為99.04%。結論：采取雙抗原夾心法對HCV抗體進行檢測的結果準確可靠，敏感性較高，臨床優勢顯著，值得關注并推廣。

關鍵詞：丙型肝炎病毒抗體；雙抗原夾心法；化學發光檢測；應用

引言

在血液篩查中，丙型肝炎病毒（HCV）是一項重要的血液篩查項目，目前主要應用到的檢測方法包括化學發光法、酶聯免疫法、時間分辨熒光免疫分析法，這些檢測方法都是間接檢測的方法。但是這些檢測方法具有假陽性率高的缺陷，進而增加了臨床檢驗成本，也給患者造成了不必要的精神負擔。因此，設計一種具有高靈敏性的Anti-HCV檢測方法就顯得極其重要。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標本材料來源

標本材料來源于2016年1月-2017年1月間南京市人民醫院血液篩選陰性樣本，隨機抽取其中的250份作為研究對象，并收集250份質控血液樣本。

1.1.2試劑材料來源

雙抗原夾心法HCV抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）：北京萬泰生物（國藥準字：S20130002，批號：2015061008），以下簡稱萬泰雙抗原夾心法。

上海浩源生物科技有限公司的丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒（I型）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）（國藥準字S20110011）。

1.2方法

選擇本次選取的一共500份血液標本進行嚴格的檢測，并應用雙抗原夾心法對HCV抗體進行檢測。

1.2.1抗原制備

第一，生物標記抗原的制備。取一定量重組融合的HCV抗原，并應用pH9.5、0.05mol/L的CB將其濃度調整為1mg/mL；根據抗體：生物素=1：10-20mol的比例添加適量已活化的生物素，在溫室中反應0.5-1.0h；將反應液移入透析袋內，并應用pH9.5、0.05mol/L的CB透析24h，最后加入等量的甘油，將其放置在零下20℃內進行保存。第二，吖啶酯標記抗原的制備取一定量重組融合HCV抗原，采用pH9.5、0.05mol/LCB調整濃度為1mg/mL；按抗原：吖啶酯=1：10-20mol比加入已活化吖啶酯，室溫反應0.5-1.0h；將反應液移至透析袋，采用pH9.5、0.05mol/LCB透析24h，加入等量甘油，放置在零下20℃內進行保存。

1.2.2操作方法

首先，將樣本與吖啶酯標記重組抗原與生物素標記重組丙型肝炎抗原進行反應，然后讓其生成抗原-抗體-抗原的夾心式復合體，將鏈霉親和素磁微粒加入其中，讓復合體與之相互作用，形成固相。其次，將反應液放置在磁場內，在反應液中的磁微粒吸附完全后，對其進行洗滌，除去未結合物。最后，注入化學發光激發液，檢測其化學發光光子的強度，并根據臨界值對其是否含有Anti-HCV樣品進行判定。

2結果

應用雙抗原夾心法對標本進行檢測，在250份標本中，206例為陽性標本，2例為陰性樣本，應用ChironRIBA確認試劑對其進行檢測，發現均成陽性，雙抗原夾心法檢測的敏感性為99.04%。具體情況詳見表1。

3討論

丙型肝炎呈全球性流行，全球HCV的感染率約為3%，我國一般人群Anti-HCV陽性率為3.2%，丙型肝炎慢性化率為50%-85%，慢性丙型肝炎的肝硬化率為10%-15%，失代償期肝硬化的10年生存率僅為25%，慢性丙型肝炎導致的肝硬化患者中，每年肝癌發生率為1%-7%。HCV常呈隱匿性感染，容易被忽視。一旦感染HCV，病程越長，越難治愈；慢性丙型肝炎可逐漸進展成肝硬化、肝細胞癌等嚴重肝臟疾患，從而造成沉重的身心負擔，故應重視丙型肝炎的篩查。丙型肝炎已有有效的治療藥物，如能及早治療，可防止其發展為肝硬化和肝癌。對丙型肝炎早期篩查、早期診斷、早期治療十分重要。因此，研制一種高靈敏度、高特異的試劑盒對丙型肝炎的防治有著重要的意義。

對患者HCV抗體進行檢測是確定其是否發生感染的初步階段，主要有用作篩檢工作的酶免疫檢測（EIA）以及用作確證工作的重組免疫印跡試驗（RIBA），其中RIBA由于需要較高費用且并未建立嚴格試驗標準，目前在臨床診療中并無較多應用。由于EIA存在較為明顯的便利性及穩定性、自動化功能強、價格較低等優點，在臨床中應用到血液篩查及檢測工作中較為廣泛。目前EIA發展至第三代，依然實施間接法予以檢測，因其方法學存在一定固有缺陷性，極易導致結果出現假陽性及漏檢情況。目前在臨床中將雙抗原夾心酶聯免疫吸附實驗法檢測試劑作為發展方向具有較為明顯的應用價值，夾心法可使得酶標記的特異性抗原將間接法檢測時酶標記的抗體進行取代，由此完成整個檢測，與間接酶聯免疫吸附實驗法進行比較，其對于樣品檢測存在雙特異性選擇特點，可以將血清內出現的抗HCV的總抗體完成檢測，有效防止間接酶聯免疫吸附實驗法所存在的檢測弊端，確保檢測結果具有更高的敏感性與特異性，而且因為HCV抗原所具有的分子量較小，以酶進行HCV抗原的直接性標記，往往使得空間位阻情況發生，導致抗體與抗原無法輕易結合，存在較為明顯抑制作用，因此HCV抗原的標記是建立抗HCV抗體的雙抗原夾心ELISA檢測方法的一個較為重要的難點。

結束語

應用雙抗原夾心法化學發光檢測實驗，可以有效提高HCV感染診斷試劑的特異性以及其檢出率，并有效縮短檢出時間，在臨床上值得推廣使用。

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