不同溫度時間條件下血漿肝功生化指標的變化和樣本穩定性分析

吉栩 汪鵬 王建柱 郭廣宏 趙秀梅 田亞平

血液樣本特別是抗凝全血是最為常見的臨床樣本之一。血液樣本的質量和臨床檢驗、科研實驗分析的結果緊密相關。有研究表明分析前因素在對結果質量的影響中占到50%以上[1]，無論臨床或是科研中都對分析前因素對樣本的影響非常重視[2-4]，因此離體后的全血樣本是否與體內狀態一致對于結果的準確性有重要的影響。全血樣本最常見的保存溫度通常為4℃和室溫，甚至可能出現接近體溫即37℃的情況。由于樣本離體后通常不能立刻進行實驗處理，通常都會經過一段時間后再處理，因此本研究選擇了4℃、室溫和37℃三個最常見的環境溫度，對樣本的放置時間選擇了0～48 h范圍內的不同時間點，對其肝功相關的6項生化指標進行分析。通過生化指標隨時間和溫度的變化趨勢，發現能保證血液樣本穩定性的溫度條件和保存時間，從而盡量使離體樣本貼近在體狀態，保證結果的準確性和分析質量。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

抗凝管（K2EDTA）購自BD，離心管、Tip頭購自Axygen，水平離心機（3-15k）購自Sigma，-80℃冰箱購自海爾，全自動生化分析儀Cobas 8000及生化分析試劑購自Roche。

1.2 血樣采集和分裝處理

本研究經中國人民解放軍總醫院倫理委員會批準，招募9名志愿者通過靜脈采血方式采集EDTA抗凝全血15 ml。血樣采集后10 min之內轉運至實驗室，并在20 min內按每份0.5 ml全血分裝至1.5 ml離心管中，分裝中持續輕柔顛倒混勻，分裝后記為初始0點，離心分離血漿。其余分裝血樣分成三組，分別置于4℃冰箱（4±1）℃、室溫（23±1）℃和37℃孵箱（37±1）℃放置2、4、6、8、12、24、36 和 48 h。

1.3 血漿制備和生化檢測

使用水平離心機對全血在3000 rpm離心10 min，取上層血漿暫時凍于-80℃冰箱，全部樣品分離后從-80℃取出4℃化凍后同時由全自動生化分析儀進行檢測，檢測指標包括丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總蛋白（TP）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和膽固醇（CHOL）共6項與肝臟功能相關的指標。

1.4 數據分析和作圖

使用GraphPad Prism 5.0對0～48 h各個生化指標在3個溫度條件下的變化趨勢繪制曲線。各時間點檢測得到的值和初始點的值進行比較，使用SPSS 17.0用配對t檢驗分析其差異顯著性，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 肝功生化指標隨溫度時間變化曲線

用各時間點的檢測值減去初始點所測值后除以初始點的值，得到各時間點相對于初始點的變化幅度，根據對應的時間點和繪制變化趨勢圖。由圖1可見，在4℃時，六項指標和初始0點相比變化幅度都不大，變化幅度的均值都未超過5%，表明在該溫度條件下數據值基本穩定。室溫時，12 h時開始偏離4℃的曲線，出現明顯的上升趨勢。37℃時，各指標在2 h均出現上升并且基本保持穩定的變化趨勢，在4 h時已經顯著偏離4℃的曲線。可見隨著環境溫度的升高，樣品的穩定性降低，常溫下保存12 h還能基本穩定，但37℃不利于生化指標保持穩定。

2.2 各時間點變化幅度的顯著性

通過配對t檢驗分析各時間點與0點所測值的差異是否顯著。4℃時，除了HDL從4～48 h與0 h均有顯著差異（P＜0.05），其余5個指標除了個別時間點（LDL在12、24 h，CHOL在6 h，AST在48 h）均無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同溫度條件和時間點下ALT、AST、CHOL、HDL、LDL、TP的變化幅度及趨勢

室溫下，所有6個指標12 h內，除了個別時間點（TP在4、6 h，CHOL在4、6、12 h）與0小時有顯著差異外（P＜0.05），均無顯著差異（P＞0.05），而從24 h開始，所有檢測值都與初始值存在顯著差異（P＜0.05）。

37℃時，2 h時CHOL和HDL與初始點有顯著差異，其余無顯著差異（P＞0.05）。但4 h開始，除了ALT在4 h時沒有顯著差異（P=0.052），其余各時間點都存在顯著差異（P＜0.05）。

3 討論

本研究目的為分析全血血漿生化指標隨溫度時間變化的規律，揭示能保證離體樣本狀態與體內的狀態盡可能一致的條件，從而保證檢測結果的正確。在檢驗或者科研中，血液樣本的分析前質量控制是一個重要的環節，除了本研究探討的樣本離體后的保存時間和溫度，還有影響生物屬性、生活習慣、藥物、采血、溶血等多種因素[1-5]。對例如凝血實驗等臨床項目對樣本存儲的溫度時間要求更為嚴格，通常要求在室溫轉運和存儲，且存儲不能超過6 h，最好在4 h內開始離心，離心不能超過1 h[6]。

隨著臨床多中心研究的開展，科研工作者也更加重視血液樣本的質量控制。研究者對應用于蛋白質組學研究的血清和血漿的前處理條件提了詳細的要求，例如采血管、溶血、暫存溫度和時間、樣本處理方式、凍融情況等[3]。本研究中重點關注處理前暫存的溫度和時間。一項對凝血實驗的分析表明，無論在4℃和室溫下放置24 h，血漿凝血酶原時間不受影響，而APTT檢測在室溫8 h內結果穩定，4℃時可達12 h，凝血因子FIX:C在4 h內穩定[7]。對心血管相關細胞因子的研究表明，溫度和時間對于不同的細胞因子和趨化因子確實存在影響，其原因可能與白細胞和血小板釋放細胞因子有關[8]。另一項研究則通過質譜分析室溫下放置半小時至48 h的血漿中820種蛋白質，結果表明4%的血漿蛋白出現明顯的降解，其中血小板反應蛋白8 h后水平上升并且24 h出現水解片段[9]。由于抗凝全血放置過程中血細胞狀態仍然在不停的變化，因此研究者比較了室溫和4℃下2、4、6、8、24和48 h的血常規結果，發現8 h后發生顯著性變化的指標數增加[10]。由此可見血液動態變化可能影響分析目標物的結果，而溫度和時間是兩個重要的環境影響因素。

本研究中選擇了三個溫度條件，并且選擇了從0-48 h中多個時間點進行分析，以更好的了解樣本的變化情況。日本研究者也對全血的生化指標等一些臨床指標進行了分析，在室溫、4℃、-20℃、-80℃的條件下分析血糖、肌酐、尿素、TBIL（總膽紅素）、AST、ALT、LD（乳酸脫氫酶）、CK（肌酸激酶）、TG（甘油三酯）等指標，觀察期為1 d、3 d、7 d，得出的結論也是隨溫度降低樣本更加穩定[11]。相比之下，本研究的時間段更為靠前，主要針對在樣本前處理階段需要進行時間和溫度控制的階段。由于選擇了37℃進行分析，可以更為全面的了解隨著溫度升高樣本穩定性的變化趨勢。結果表明，37℃時樣本的穩定性很差，因此在高溫環境下的操作，比如熱帶地區或者其他特殊情況，需要更加及時的處理樣本以保證樣本的質量，及時轉移至4℃有利于保證樣本的穩定。

[1] Cicognola C，Chiasserini D，Parnetti L. Preanalytical Confounding Factors in the Analysis of Cerebrospinal Fluid Biomarkers for Alzheimer's Disease：The Issue of Diurnal Variation[J]. Front Neurol，2015（6）：143.

[2] Mohammedsaleh ZM，Mohammedsaleh F. A review article of the reduce errors in medical laboratories[J]. Glob J Health Sci，2014，7（1）：46-51.

[3] Yin P，Lehmann R，Xu G. Effects of pre-analytical processes on blood samples used in metabolomics studies[J]. Anal Bioanal Chem，2015，407（17）：4879-4892.

[4] Mohamadkhani A，Poustchi H. Repository of Human Blood Derivative Biospecimens in Biobank： Technical Implications[J].Middle East J Dig Dis，2015，7（2）：61-68.

[5] Ilies M，Iuga CA，Loghin F，et al. Impact of blood sample collection methods on blood protein profiling studies[J]. Clin Chim Acta，2017（471）：128-134.

[6] Magnette A，Chatelain M，Chatelain B，et al. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory：guidance for the clinical laboratories[J].Thromb J，2016（14）：49.

[7] Feng L，Zhao Y，Zhao H，et al. Effects of storage time and temperature on coagulation tests and factors in fresh plasma[J]. Sci Rep，2014（4）：3868.

[8] Lombardi G，Sansoni V，Banfi G. Measuring myokines with cardiovascular functions：pre-analytical variables affecting the analytical output[J]. Ann Transl Med，2017，5（15）：299.

[9] Kaisar M，van Dullemen LFA，Thézénas ML，et al. Plasma degradome affected by variable storage of human blood[J]. Clin Proteomics，2016（13）：26.

[10] Buoro S，Mecca T，Seghezzi M，et al. Assessment of blood sample stability for complete blood count using the Sysmex XN-9000 and Mindray BC-6800 analyzers[J]. Rev Bras Hematol Hemoter，2016，38（3）：225-239.

[11] Ikeda K，Ichihara K，Hashiguchi T，et al. Evaluation of the shortterm stability of specimens for clinical laboratory testing[J]. Biopreserv Biobank，2015，13（2）：135-143.