轉錄因子DREB1A基因的克隆及植物表達載體的構建

柳娜　楊文雄

摘要：研究轉錄因子DREB1A在植物抗滲透脅迫反應中的作用。根據GenBank中登錄的DREB1A基因的序列設計引物，用PCR方法從擬南芥中克隆DREB1A基因，利用基因重組技術成功構建了植物表達載體pCAMB1A1300-DREB1A。該結果為進一步利用DREB1A基因做遺傳轉化研究奠定了基礎。

關鍵詞：轉錄因子；DREB1A基因；植物表達載體

中圖分類號：Q943.2 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）11-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.009

Cloning of Transcription Factor DREB1A Gene and Construction of Plant Expression Vector

LIU Na， YANG Wenxiong

（Institute of Wheat， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：To research the function of the transcription factor DREB1A in plant tolerance to osmotic stress， a pair of primers was designed according to the sequence of DREB1A gene in GenBank databases. The DREB1A gene was cloned from Arabidopsis thaliarra by the method of PCR. By the method of Recombinant DNA Technology， plant expression vector pCAMB1A1300-DREB1A was successfully constructed. The results laid a foundation for further research on genetic transformation using DREB1A gene.

Key words：Transcription factor； DREB1A gene； Plant expression vector

干旱、鹽堿和低溫等逆境是影響作物生長發育的主要限制因子，改善環境脅迫的耐受性對提高作物產量具有重要意義[1 - 3 ]。環境脅迫能誘導許多植物基因的表達，有些基因的表達產物可直接增強脅迫耐性，有些可以感應和轉導脅迫信號調控基因表達[4 - 5 ]。因此，抗逆相關基因的克隆、表達調控及功能分析等研究，為作物抗逆育種提供了潛在的有效途徑。干旱又是制約甘肅小麥生產的首要因素，提高小麥對干旱脅迫的耐受性來增加小麥產量，將極大地提高甘肅應對糧食安全問題的能力。加強具有抗旱基因資源的發掘和創新，開展抗旱生理和遺傳學研究，利用基因工程技術實現不同物種間抗旱基因的轉移，提高植物的耐旱能力，是目前研究的熱點之一[6 ]。植物的耐旱性是一個復雜的多基因控制系統，而轉錄因子有一部分與抗逆性有關，參與滲透脅迫的信號轉導和功能基因表達調控，在植物抗滲透脅迫反應中起關鍵作用[7 - 11 ]。已有的研究表明，DREB是個小基因家族，編碼3個相關的轉錄因子， DREBlA是這個小基因家族的重要成員之一，它對抗滲透脅迫基因的啟動起著“ 主開關”的作用， 在逆境脅迫下主動調控相關基因的表達， 并在脅迫信號傳遞中起重要作用。我們從擬南芥中克隆轉錄因子DREBlA，并構建由CaMV35S啟動子調控的植物表達載體，旨在為進一步利用DREBlA基因做小麥遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

哥倫比亞生態型擬南芥幼苗由甘肅省農業科學院小麥研究所種質創新實驗室提供。pMD19-T vector、pCAMBIA1300-N-eGFP載體、大腸桿菌菌株DH5a均購自大連寶生物工程有限公司。

Taq酶、氨卞青霉素、卡拉霉素、IPTG、X-gal、T4 DNA連接酶、DNA回收試劑盒等其他試劑均購自TaKaRa公司，引物合成和基因測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥葉片基因組 RNA 的提取 使用植物基因組試劑盒提取擬南芥葉片基因組RNA，然后通過RT-PCR反轉錄成cDNA。以反轉錄的cDNA 為模板，用設計好的上下游引物擴增DREB1A基因，采用1%的瓊脂糖凝膠檢測 DNA 的完整性。

1.2.2 DREB1A基因克隆及載體構建 根據Genebank中擬南芥DREB1A基因序列（登錄號：EF156749），應用Primer Premier 5.0軟件分析其內部酶切位點情況。設計1對引物，并根據后續構建植物表達載體的需要，在上游引物一端加入l個XbaI位點，在下游引物一端加入了BamH I位點。設計PCR引物如下：上游引物D1：5GCTCTAGA ATGAACTCATTTTCTGCT-3XbaI；下游引物D2：5GCCCTAGG GTCGCATCACACATCTC 3 BamHI。PCR反應體系總體積為50.0 μL，包括5xbuffer 10.0 μL、10 mmol/L上游引物1.0 μL、下游引物1.0 uL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，Primer STAR 1.0 μL加ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性2.0 min、94 ℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72 ℃ 1.0 min。35個循環后72 ℃延伸10.0 min。PCR 產物經1.0%瓊脂糖電泳檢測后，擴增片段大小為561 bp（圖1）。將擴增片段用DNA凝膠回收試劑盒回收純化（操作程序根據試劑盒說明書進行，回收后的DNA片段加A尾。連接到克隆載體pMD19-T載體，將經PCR檢測和XbaI/BamH I雙酶切鑒定呈陽性的克隆命名為T-DREB1A，送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序，采用DNAMAN軟件分析比對測序結果。

1.2.3 擬南芥DREB1A基因表達載體的構建 將測序合適的T-DREB1A載體質粒用核酸內切酶XbaI和BamH II酶切，回收DREB1A片段。同時將pCAMBIA1300-N-eGFP載體用此2個酶切，回收載體。回收雙酶切產物，用T4DNA 連接酶將DREB 1A片段接到pCAMBIA1300載體中。連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞。菌液PCR鑒定構建的DREB1A基因植物表達載體，并將陽性克隆送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 DREB1A基因的克隆與測序結果

分別以DI、D2為上下游引物，以cDNA模板，擴增出561 bp的特異帶，與預期的DREB1A基因大小相符（圖1）。將擴增片段鏈接到克隆載體pMD19-T，測序后與GenBank中的擬南芥DREB基因序列進行比對，結果表明2個序列完全一致，說明獲得的擬南芥DREB基因編碼區是正確的，沒有發生堿基變化，可以用來構建植物表達載體。

2.2 植物表達載體p1300-DREB1A構建

用前向帶有XbaI和反向帶有BamH I酶切位點的擬南芥DREB基因引物，以pMD19-T-DREB 質粒為模板，經內切酶切割回收目的片段。目的片段回收純化后，用XbaI和BamH I酶切，連接到用相同酶切回收后的表達載體pCAMBIA1300上，轉化E.coli DH5α，獲得pCAMBIA1300-DREB表達載體（圖2）。對重組質粒進行PCR鑒定，擴增出一條長約561 bp的目的基因條帶（圖3）。將陽性克隆測序，序列比對結果正確，說明擬南芥DREB 基因表達載體構建成功。

3 結論與討論

用PCR方法從擬南芥中克隆了DREB1A基因，序列分析發現克隆的DREB1A基因與已發表的DREB1A基因序列（EF156749）的同源性為99.85%。利用基因重組技術成功構建了由CaMV35S啟動于調控的植物表達載體p1300-DREB1A.為進一步利用DREB 1A基因綜合改良植物抗旱性奠定基礎。

植物感受外界干旱、高鹽、激素、病害及體內細胞發育等信號，通過一系列信號傳遞激發轉錄因子，轉錄因子與基因啟動子區域的順式作用元件結合后，激活RNA聚合酶Ⅱ轉錄復合物，從而啟動基因的的轉錄表達，最后通過基因產物的作用對外界信號在生理生化等方面做出適合的調節反應。DREB轉錄因子參與對干旱 、高鹽和低溫等逆境脅迫的應答，介導植物非ABA依賴的滲透脅迫信號的傳遞。DREB 轉錄因子可以和DRE順式元件或具有DRE核心序列的元件特異性結合，調控下游相關基因的轉錄表達，提高對低溫、干旱和高鹽的抗性。因此，DREB類轉錄因子在基因的表達調控方面起著非常重要的作用。目前，已從不同的作物中克隆到這類轉錄因子，并對其功能進行了研究。

參考文獻：

[1] NI Z Y，HU Z，JIANG Q Y，et al. GmNFYA3，a target gene of miR169，is a positive regulator of plant tolerance to drought stress[J]. Plant Mol. Biol.，2013，82：113-129.

[2] 倪志勇，徐兆師，李連城，等. DREB轉錄因子在植物逆境脅迫中的作用機理及應用研究進展[J]. 麥類作物學報，2008，28（6）：1100-1106.

[3]張永恩，李潮海，王 群. 植物抗旱相關基因研究進展[J]. 中國農學通報，2004，20（6）：85-88.

[4]YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K. A novel cisacting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，low-temperature，or high-salt stress[J]. Plan Cell，1994，6（2）：251-264.

[5] 張騰國，郭艷峰，陳瓊瓊，等. 油菜COR基因的克隆及原核表達[J]. 甘肅農業科技，2015（4）：1-4.

[6] 孫立平，李德全. LEA蛋白的分子生物學研究進展[J]. 生物技術通報，2003（6）：5-13.

[7]劉 強，趙南明，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，等.DREB轉錄因子在提高植物抗逆性的作用[J]. 科學通報，2000，45（1）：11-16.

[8] 王艷青，陳雪梅，李 悅，等. 植物抗逆中的滲透調節物質及其轉基因工程進展[J]. 北京林業大學學報，2001，23（4）：66-70.

[9] 倪志勇，馬文靜，呂 萌，等. 棉花肉桂醇脫氫酶基因GhCAD6的克隆及正義、反義與RNAi干擾載體的構建[J]. 華北農學報，2009，24（6）：20-26.

[10] 賈小霞，文國宏，李高峰，等. 擬南芥 DREB1A 基因的克隆與植物表達載體構建[J]. 甘肅農業科技，2011（6）：18-21.

[11] 奧斯伯F，金斯頓R F，布倫特R，等. 精編分子生物學實驗指南[M]. 顏子穎，王海林，譯. 北京：科學出版社，1999.

（本文責編：楊 杰）