微生物保藏研究進展

郭佳文 季佳鑫 陳佳明 劉思伯

摘 要：剖析了厭氧氨氧化菌種低溫保藏的影響因素，保藏溫度對厭氧氨氧化顆粒污泥特性的影響，間歇性饑餓對厭氧氨氧化菌混培物保藏特性的影響。最后指出，厭氧氨氧化菌種低溫保藏的條件。

關鍵詞：厭氧氨氧化；保藏條件；條件影響

研究厭氧氨氧化菌混合物的保藏方法的研究有利于環境的進一步凈化，而保藏工藝有利于氨氧化菌的保存，以更好的減少污染凈化環境，而收集文獻的目的是為了更好地證明這種保藏方法的正確性[1，2]。

1.厭氧氨氧化菌低溫保藏的影響因素

1.1保藏溫度

厭氧氨氧化菌對溫度變化比較敏感，在正常進行厭氧氨氧化反應階段，所需的最佳溫度范圍是6～43℃。然而保藏厭氧氨氧化菌種時，保藏溫度也會影響厭氧氨氧化菌的生存狀態及后期恢復活性時的速度，因而選擇恰當的保藏溫度至關重要[3]。

1.2保護劑

1.2.1海藻糖

海藻糖是生物組織的非特異性天然保護劑，屬于非滲透性低溫保護劑，可使動植物和微生物等有機體在冷凍、高溫、脫水、高滲透壓及有毒試劑等環境中仍保持生命活力。可見，低溫下添加海藻糖有助于減緩低溫損害，但海藻糖的添加量需結合具體保藏條件而具體設定。然而，迄今尚未見海藻糖在厭氧氨氧化菌種保藏中使用的報道。

1.2.2二甲亞砜

DMSO也是一種常見的冷凍保護劑，在常溫下其毒性較強，其毒性隨著溫度的降低而減小，如在低溫下（4℃）添加DMSO，可降低其對細胞的毒害作用。DMSO還具有抗凝集作用，可促使單個細胞正常生存。

1.2.3甘油

作為一種常見的冷凍保護劑，甘油的使用在實驗室中較常見.它能降低冷凍液的滲透壓，減緩細胞受滲透壓的脅迫，它還能滲透進入細胞體內來平衡細胞內的水分

1.3保藏時間

保藏時間也會影響菌種保藏效果.所需要的保藏時間不同，相應的保藏方法也有所差別。一般而言，菌體活性會隨著保藏時間的延長先下降后趨于穩定，若保藏時間較短時，采用常溫保藏法既不會對菌體活性變化產生顯著影響，又能節省成本；當保藏時間較長時，低溫的選取也需盡可能地實現“雙贏”（活性抑制程度不受影響，節約成本）。

1.4基質條件

保藏菌種的培養基如何配制也是值得考慮的部分。硝酸鹽作為緩沖劑，在活性恢復時會隨著保藏時間的不同出現不同的遲滯效應[4]。有學者也用過蒸餾水和葡萄糖分別作為基質，發現以蒸餾水為基質的效果較好。

進行厭氧氨氧化菌種保藏時，菌種保藏環境（保藏溫度、保護劑的選擇、基質等）的設定直接關系到細菌的生存狀態。在上述諸多保藏方法中，如今廣泛應用的是冷凍法，甘油和海藻糖是較為推薦的保護劑，但添加合適濃度的DMSO，菌種活性恢復效果很好。保護劑的使用與保藏溫度和保藏時間息息相關，菌種活性恢復效果更是依賴于保藏環境和解凍過程。總之，無論是保藏環境還是解凍處理，都與厭氧氨氧化菌本身的生理特性有關。千篇一律地使用一種保藏方法，以及采用雷同的操作條件均不足取，需結合實際現有條件具體分析[5]。

2.保藏溫度對厭氧氨氧化顆粒污泥特性的影響

實驗首先通過 HRT 調控進水基質負荷培養厭氧氨氧化顆粒污泥，并采用 KHCO3 和 NaHCO3 交替提供無機碳源。然后分別在–40 ℃、4 ℃、（27±4） ℃室溫和 35 ℃條件下避光保藏。結果表明，NaHCO3 可代替 KHCO3 作為厭氧氨氧化菌生長的無機碳源。相比于其他保藏溫度，4 ℃保藏能夠較好地維持生物量和生物活性，同時能較好地維持顆粒污泥的沉降性能、顆粒污泥和細胞結構完整性。同時，顆粒污泥胞外聚合物中蛋白質與多糖的比值 （PN/PS） 和血紅素不能有效指示保藏過程中顆粒污泥沉降性能和活性的變化，而生物活性與胞溶程度呈負相關[6]。

3.間歇性饑餓對厭氧氨氧化菌混培物保藏特性的影響

3.1間歇性饑餓對厭氧氨氧化菌混培物的危害

大于長期性饑餓，且亞硝態氮濃度越高產生的危害越大。采用 R1（4℃）、R2（4℃并每隔10 d換一次NO2- /NH4+為1.32的基質）、R3 （4℃并每隔10 d換一次 NO2-/NH4+為1.63的基質）3種方法保藏的厭氧氨氧化菌混培物，活性均先快速下降后趨于穩定，但三者的衰減速率始終為 R1< R2

3.2厭氧氨氧化菌混培物活性與血紅素 c含量有直接相關性，保藏過程中的血紅素 c含量衰減速率與活性衰減速率趨于一致.無外界顏色干擾時厭氧氨氧化菌混培物顏色可直觀反映其活性和血紅素c 含量，但有外界干擾時顏色與活性和血紅素 c含量間無任何相關性[7]。

3.3饑餓保藏過程中，高濃度亞硝酸鹽條件下厭氧氨氧化菌體死亡自溶現象更嚴重，但厭氧氨氧化菌混培物的顆粒結構及其富含的胞外多聚物增強了其抵抗外界不利因素的能力。

目前為止，有關厭氧氨氧化菌保藏的報道還僅見低溫和常溫的保藏方法。 對于動物來說，早有實驗表明動物短期饑餓后其食欲會增大，如果間歇性饑餓對于厭氧氨氧化菌來說有同樣功效的話那將是環境工程界的幸事，尤其對于厭氧氨氧化菌的保藏來說。

結論：厭氧氨氧化菌為自養菌，當環境中存在有機物時，其基質亞硝酸鹽易受反硝化菌的競爭。厭氧氨氧化菌對環境條件 （如水質、溫度） 敏感，對毒性物質適應能力較差。迄今為止，厭氧氨氧化工藝的應用僅局限于少數幾種低 C/N 和易生物處理的廢水。因此研究最適宜的菌種保藏條件對厭氧氨氧化工藝的推廣應用具有重大的現實意義。總之，無論是保藏環境還是解凍處理，都與厭氧氨氧化菌本身的生理特性有關。千篇一律地使用一種保藏方法，以及采用雷同的操作條件均不足取，需結合實際現有條件具體分析。

參考文獻：

[1]汪彩華[6]，鄭平，胡安輝.硝化產物對硝化細菌混培物保藏特性的影響[J].中國環境科學，2011，31（10）：1663-1668.

[2]汪彩華，鄭平，蔡靖等.厭氧氨氧化菌混培物保藏方法的研究[J].中國環境科學，2013，33（8）：1474-1482.

[3]李祥，鄭宇慧，黃勇等.保存溫度及時間對厭氧氨氧化污泥活性的影響[J].中國環境科學，2011，31（1）：56-61.

[4] 唐崇儉，鄭平，陳建偉.流加菌種對厭氧氨氧化工藝的影響[J].生物工程學報， 2011，27（1）： 1-8.

[5]于英翠，高大文，陶彧等.利用序批式生物膜反應器啟動厭氧氨氧化研究[J].中國環境科學，2012，32（5）：843-849.

[6]唐崇儉，鄭平，陳建偉，等.基于基質濃度的厭氧氨氧化工藝運行策略[J].化工學報，2009，60（3）：718-725.

[7]張蕾，鄭平，胡安輝.鐵離子對厭氧氨氧化反應器性能的影響[J].環境科學學報，2009，29（8）：1629-1634.