ATP發光法在日化產品抗菌抑菌快速檢測方面應用的可行性研究

邱皓璞 張弛 王曉麗 朱榮

摘 要：以日化產品作為檢測對象，以QB/T 2738-2012中對日化產品抗菌抑菌效果的檢驗方法為基礎，通過ATP發光法與行業標準中懸液定量法的對比，對ATP發光法在快速檢測日化產品的抗菌抑菌性的應用上的可行性及準確性進行評價。為國家對日化產品的監管提供新技術支持。

關鍵詞：ATP發光法，快速檢測，日化產品，抗菌抑菌性

在輕工行業標準QB/T 2738-2012中規定了日化產品中抗菌抑菌性的檢測方法：懸液定量法和抑菌環法。但這兩種方法都存在弊端，懸液定量法是利用細菌懸液進行常規微生物培養基培養后進行計數，耗時較長。抑菌環法則是使用量取抑菌環大小的方法來測定產品中的微生物指標，容易受外界影響，結果準確性低。

三磷酸腺苷（ATP）是一種存在于活著的所有生物細胞中的化學物質，活菌中含有一定量的ATP，如1個革蘭氏陽性菌的ATP含量約為1*10-18 g，革蘭氏陰性菌是陽性菌的10倍，而酵母又是革蘭氏陰性菌的10倍。ATP、熒光素、氧氣，在Mg2+存在的條件下與熒光素酶發生反應，進行發光。

由于其發光量根據ATP量的比例進行，因此可以通過測定發光量來測定生物由來的ATP量，其檢出限在細菌數102～103 cfu/mL。有研究表明ATP發光量與活菌數之間有較好的線性關系，且其在細胞死亡后極易降解的特性，使其成為較好的活菌的檢測指標。目前ATP發光法已經在國內外廣泛應用于在牛乳、豆腐等無細胞食品和水質、工作臺面等環境中活菌的檢測。因此，在日化產品的抗菌抑菌性檢測方面的應用也值得期待。

材料與方法

1 儀器與材料

1.1主要儀器：3MTMClean-TraceTMATP熒光檢測系統（3M公司），3MTMClean-TraceTMATP水質采樣棒（3M公司）

1.2其它儀器及試劑：高壓滅菌鍋（TOMY SX-700）、生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠SPX-250B-Z型MODEL SPX-250B-Z）、旋渦混合器、一次性滅菌平皿、1000μl，200μl移液槍及滅菌槍頭、 營養肉湯（北京陸橋）、營養瓊脂（北京陸橋）。

1.3實驗菌種：大腸桿菌（E.coil） ATCC 25922（American type culture collection）、金黃色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 6538（American type culture collection）

1.4檢驗樣品來源：來自市場的不同品牌和種類的洗手液，洗滌劑，洗潔精等產品如寶潔，白貓，聯合利華，雕牌，浪奇，綠傘，滴露，威露士，汰漬，藍月亮，奧妙，超能，花王，奇強，舒膚佳，六神等著名日化品牌的產品。

2 方法

2.1 ATP發光法檢測與懸液定量法的關聯性判定

通過ATP熒光檢測儀測定不同稀釋梯度的菌種懸液，并將各組數據匯總統計。再將繼續稀釋至一定范圍的菌種懸液用懸液定量法，36℃，48h培養后計算CFU值，與ATP發光值進行對比。

2.2 ATP發光檢測方法與行業標準方法的對比試驗

行業標準具體方法參照QB/T 2738-2012中的懸液定量法，制備細菌繁殖體懸液，用合適的中和試劑稀釋菌種懸液樣品，與待測樣品反應后，稀釋至相應的濃度，倒入培養基，同時進行對照實驗。經過37℃，48h培養后，對平板上形成 的單菌落進行計數（cfu/mL）。

ATP發光法檢測一定濃度的菌種懸液，加入待測抗菌抑菌產品，反應與懸液定量法相同時間，將ATP水質采樣棒放入試管中取樣，用ATP熒光檢測儀進行讀取數據。

3 數據處理與分析

將菌落計數方法測得的值及ATP方法測得值，按照（消毒前菌液濃度-消毒后菌液濃度）/消毒前菌液濃度，得出抑菌抗菌率。將行標方法計算的抑菌抗菌率與ATP方法計算的殺菌率進行pearson相關系數的計算。當p值<0.05，則判斷2個方法的值相關，ATP發光法具有可行性，反之則無可行性。

結果

1 ATP發光法檢測與懸液定量法的關聯性判定

ATP發光值與活菌菌落數呈現良好的線性關系。如fig.1和fig.2所示，菌液在1*103～9*105cfu/mL濃度范圍內，無論E.coil（R2=0.9999）還是S. aureus（R2=0.9998）

2 ATP快速檢測法與懸液定量法計算抗菌抑菌性值對比

結果見表1。ATP發光方法計算的殺菌率的值與懸液定量法計算的值進行比較，peason相關系數分別為0.998（E.coil）和0.999（S. aureus），p值分別為0.000和0.000，小于0.05，表現出較強的相關性。

討論

3MTMClean-TraceTM ATP熒光檢測系統的有效菌液測定范圍在1*103～9*105cfu/mL，比傳統的ATP發光法測定的值相比，測定值與測定范圍都較低，這應該與水質采樣棒的采樣方法相關。但與傳統的ATP方法相同，運用ATP快速檢測系統進行抗菌抑菌性的檢測與懸液定量法得到的結果具有較高的相關性（p=0.000）。這是因為ATP快速檢測系統，雖然在菌液濃度的有效測量范圍上比ATP傳統方法測得值低且范圍小，但由于抗菌抑菌性的計算方式，因此在運用ATP快速檢測系統測量抗菌抑菌性時，并不會對結果造成影響。且在檢測時間上ATP快速檢測系統可以在1分鐘內完成抗菌抑菌性的檢測，比傳統的ATP發光法更加快速，而傳統的懸液定量法至少需要48小時。在檢測方法上， ATP快速熒光檢測系統也比懸液定量法更為簡便，可以同時進行大批量的檢測，而懸液定量法由于操作上的局限性，步驟更為繁瑣，也無法同時進行大批量操作。由實驗結果可以看出，ATP 生物發光法比傳統的懸液定量法更為快速、方便，可以應用于日化產品抗菌抑菌性的快速檢測領域。

參考文獻：

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項目名稱：應用ATP發光法的日化產品抗菌抑菌檢測方法研究

項目編號：KJ2014004

作者簡介：

邱皓璞 1989.5 男 江蘇南京 助理工程師 學士學位，研究方向：食品相關產品