胞內冰形成機理研究進展

寶林

(上海理工大學生物系統熱科學研究所 上海 200093)

生物樣本庫的建立和細胞藥物的興起對生物樣本的低溫保存質量提出了更高的要求。如何有效保存各類生物樣本，提高保存質量是目前亟待解決的問題。細胞是生物樣本最小的結構單元，也是低溫保存生物樣本的基本單位。生物樣本的低溫保存主要有兩種方式，低溫凍存和玻璃化保存[1]。玻璃化保存是最理想的細胞低溫保存方式，由于沒有冰晶的形成和冰晶形成帶來的未凍組分的溶液質量摩爾濃度上升，理論上認為不會造成細胞損傷[2]，但實現玻璃化往往要求高質量摩爾濃度的低溫保護劑或極快的降溫速率，而高質量摩爾濃度的低溫保護劑會對細胞產生毒性，超快的降溫速率也意味著更高的設備要求及成本，面對大體積樣本，受制于傳熱的問題， 要實現樣本各部分的超快速降溫非常困難[3]。在實驗或醫學中常用的是低溫凍存，其設備要求更低，但是在凍存過程中，水分子結晶引起的一系列變化會造成細胞的損傷。Liu Baolin等[4]研究了低溫凍存過程中冰晶對黏附成骨細胞的損傷機制，發現冰晶的生長會直接使細胞產生形變，相比于分散的細胞，黏附在載體上的細胞損傷更嚴重。郝保同等[5]發現冰晶生長方向的不同對黏附成骨細胞的損傷也不同，當冰晶生長的方向與黏附成骨細胞中軸線的夾角為0°～30°時，細胞的存活率最高。梁瑋等[6]在基因層面上研究了低溫保存對人肝癌細胞Hep-G2的影響，發現低溫保存會影響細胞內凋亡基因的表達。所以提高生物樣本的低溫凍存質量，必須了解細胞在低溫凍存過程中受損傷的原因。如圖1所示，細胞在凍存過程中受到的最主要的損傷有兩種[7]：溶質損傷和胞內冰損傷。溶質損傷是指在降溫速率較慢的情況下，細胞外部生成冰晶使胞外溶液質量摩爾濃度上升，細胞內外的滲透壓差異使細胞內部的水分擴散至胞外，使細胞內的細胞器以及其他內容物在較長時間內處于高滲的溶液中而造成的損傷。胞內冰損傷是指在降溫速率較快時，細胞內的水分來不及滲出而在細胞內部形成冰晶，細胞內冰晶的形成對細胞結構產生破壞從而產生機械損傷[8]。

胞內冰的形成往往意味著細胞的死亡。在生物樣本的低溫保存過程中需要抑制胞內冰的形成，而在低溫外科手術過程中要利用胞內冰有效殺死腫瘤細胞，因此了解胞內冰的形成機理至關重要。胞內冰形成的關鍵在于細胞膜，細胞膜被認為是阻止冰晶生長的天然屏障[9]，關于胞內冰的形成機理圍繞細胞膜分為兩種觀點，一種以P. Mazur等[10-11]為代表，認為胞內冰的形成破壞了細胞膜結構，胞內冰是細胞膜被破壞的原因；另一種以K. Muldrew等[9]為代表持相反意見，認為胞內冰是細胞膜被破壞的結果，在低溫凍存過程中，由于胞外冰的生成造成細胞膜損傷，失去對冰晶的屏蔽作用，導致胞內冰的形成。但是關于胞內冰形成的假說至今沒有直接的實驗證據。本文在分析前人研究成果的基礎上，綜合現有實驗結果，分析上述假說的合理性以及存在的問題。

1 降溫過程的胞內冰

1.1 冰晶生長理論

冰晶的生長過程實際是水分子在晶核表面形成氫鍵并有序排列的過程，水分子結晶包括兩個過程[12]：晶核的形成和冰晶的生長。晶核存在一個臨界尺寸，晶核大于臨界尺寸時冰晶才能進一步生長，晶核小于臨界尺寸時則融化。晶核的大小和體系的過冷度相關[13]，過冷度越大，晶核小而多，形成密集的小冰晶；過冷度小時，晶核大而少，形成大冰晶。對于低溫保存而言，大冰晶意味著更大的機械損傷，小而密的冰晶保存效果更理想。對于低溫外科手術而言，大冰晶的形成具有更大的殺傷力。在實際冰晶生長過程中存在勻相成核和異相成核兩種情況：勻相成核是指整個體系中的冰晶成核概率一致，成核均勻地發生在體系中；異相成核是指體系中存在雜質，可以作為冰晶生長的晶核使水分子在表面結晶，實際水結晶過程大多數為非勻相成核。

低溫保存過程中形成冰晶需要3個要素：1)足夠高的自由水分子摩爾濃度；2)足夠長的冰晶生長時間；3)足夠低的成鍵溫度。自由移動的水分子能夠參與冰晶的生長，結合態的水分子不能參與冰晶的形成。足夠高的自由水分子摩爾濃度保證水分子之間有足夠大的有效碰撞幾率來形成氫鍵，親水性的低溫保護劑能抑制冰晶生長的原因之一是分子中含有很多親水性基團，能夠與溶液體系中的自由水分子形成氫鍵，減少體系中的自由水分子摩爾濃度[14]，減少或者抑制冰晶的生長。在玻璃化過程中使用高質量摩爾濃度的低溫保護劑使體系中的自由水含量大大減少，極大地降低了冰晶的生成幾率。冰晶的生長需要足夠長的時間。在低溫保存過程中隨著溫度的降低，水分子移動變緩，如果降溫速率足夠快，使冰晶沒有足夠的時間進行生長，玻璃化保存中的超高降溫速率使水分子移動變得十分緩慢，且低的自由水含量使冰晶難以形成，形成了無冰晶的固體玻璃態。足夠低的成鍵溫度使氫鍵有效形成而不被破壞，維持冰晶不融化。

1.2 影響胞內冰形成的因素

P. Mazur[10]認為影響胞內冰形成的因素主要是降溫速率、細胞對水的滲透率、胞外冰和細胞外懸浮介質等。體積小且滲透水能力高的細胞需要更高的降溫速率才能生成胞內冰，如紅細胞需要超過5 000 ℃/min的降溫速率才能形成胞內冰，而體積更大且水滲透能力更低的酵母細胞則只要10 ℃/min的降溫速率就能形成胞內冰[15]。

在降溫過程中，細胞外的溶液先降溫到溶液的凝固點以下，實驗表明胞外冰的產生先于胞內冰[16]，通過DSC測量整個胞內冰的形成過程，結果顯示整個降溫過程中出現兩個放熱事件，大的放熱峰表示胞外冰的形成，小的放熱峰表示胞內冰的產生，大放熱事件總是先于小放熱事件說明胞外冰的形成總是先于胞內冰。胞外冰的形成是細胞在降溫過程中形成胞內冰的前提條件。

Huang H.等[3]研究海藻酸鹽水凝膠對于細胞的保護作用時發現，當膠囊外部的溶液產生冰晶時會引起胞內冰，但是將膠囊外部替換成無法產生冰晶的礦物油，可以完全抑制胞內冰的產生。這和實際的細胞低溫保存存在差異：1)細胞低溫保存過程中細胞膜是直接接觸到保護劑溶液，而在膠囊中與細胞直接接觸的是水凝膠；2)當膠囊外部的液體由保護劑溶液替換成油時，不僅改變了胞外冰，也改變了胞外液體的導熱率，需要進行進一步實驗驗證，如找到和低溫保護劑相同熱物性參數的油來減少變量。1970年，有學者通過研究DNA、可溶膠原蛋白、胰島素及膠原酶等的水溶液在過冷下的成核能力，表明胞內生物大分子不能作為形成胞內冰的晶核[15]。M. Toner等[11]也觀察到豬卵母細胞降溫至-20 ℃時，在沒有胞外冰的情況下，胞內冰也沒有產生，直到-20 ℃以下胞內冰與胞外冰才同時產生。

胞外冰的形成總是先于胞內冰，但胞外冰如何引起胞內冰還未得到實驗驗證，因為胞內冰形成時間非常短，在人工置核的條件下，胞內冰的發生只有1.6 ms[17]。受制于有限的觀測手段，現有實驗都是間接的理論驗證。此外，細胞外懸浮介質也能影響胞內冰的形成，胞內冰的生成溫度與低溫保護劑的質量摩爾濃度成正比，增加低溫保護劑的質量摩爾濃度能很大程度上提高細胞的過冷度，抑制胞內冰的發生[17]。

1.3 孔理論

以P. Mazur[10]為代表的學者認為胞內冰晶生長的晶核直接來自于細胞外部的冰晶，胞外冰可以通過細胞膜上的微孔進入細胞，為胞內冰晶的生長提供晶核，胞外冰是胞內冰形成的必需條件。1960年，P. Mazur[10]以酵母、巴氏桿菌和黃曲霉孢子為研究材料，在確定低溫本身對細胞無害的基礎上，發現降溫過程中存在一個使細胞存活率顯著下降的較小的溫度區間，且該區間為發生相變的區間，對細胞的傷害是瞬時的。

P. Mazur[10]綜合實驗結果認為胞內冰的具體生長過程為：細胞懸液在降溫過程中隨著溫度降至0 ℃以下，細胞內外都沒有冰晶形成，細胞內外的水分保持過冷狀態，此時細胞沒有受到損傷，實驗表明：冰晶一旦生成，細胞的存活率會急劇下降，說明相比于體系能量的降低，水分的相變更為致命。如圖2所示，隨著溫度的繼續下降，細胞外介質開始結冰，當體系的溫度足夠低，降溫速率足夠快時，冰晶才能通過細胞膜上的小孔進入胞內引起胞內水分的結晶。P. Mazur[10]假設冰晶若要通過細胞膜上的小孔，其尖端必須有足夠小的曲率半徑，而提高降溫速率或升高過冷度能夠增大冰晶形成的驅動力，減小冰晶生長前端的曲率半徑，同時提高降溫速率也使細胞內的水分來不及運輸到胞外。

圖2 冰晶通過細胞膜微孔進入細胞內部Fig.2 Ice crystals enter the cell through the cell membrane pore

P. Mazur[18]1965年給出了胞內冰形成溫度和細胞膜小孔孔徑的數學關系式：

(1)

(2)

式中：ΔT為水在膜孔內的凝固點與水在冰水平面界面上的凝固點Tf之間的差值,℃；v1為水的摩爾體積,m3；σsl為冰水界面自由能,10-7J/cm2；a為膜孔半徑,10-10m;Lf為冰融化的摩爾熱,J；θ為冰晶前端與孔壁的接觸角;σsc為冰晶和孔壁的界面自由能,10-7J/cm2；σlc為水和孔壁的界面自由能,10-7J/cm2。其中，σsl≈2×10-6J/cm2，帶入其他已知變量可得：

(3)

假設冰晶與孔壁之間的接觸角θ=0°，則cosθ=1，當a=3×10-9m時，ΔT=10 ℃，符合對應的實驗證據；當假設接觸角θ=80°，a=5×10-10m，ΔT=10 ℃。方程顯示對于指定大小的膜孔，水在膜孔內的凝固點與水在冰水平面界面上的凝固點之間存在一個固定的溫度差值，決定了胞內冰能否通過該孔道生長。1996年W. K. Berger等[19]研究了冰晶在唾液腺組織細胞之間的傳播，結果顯示該傳播過程和溫度有很大相關性，在固定溫度以上觀察不到冰晶在細胞間的傳播。該結果支持了冰晶可以通過孔道進行傳播。2001年J. P. Acker等[20]在P. Mazur[18]基礎上改進了孔理論模型。該模型考慮了實際細胞低溫保存過程中，胞外是水溶液而不是純水，公式為：

(4)

修正后的公式顯示，在相同接觸角下，相同的膜孔徑，修正后的ΔT更大，原因是相比于純水，水溶液的凝固點會有所下降，使生成胞內冰的溫度更低，過冷度更大。

1.4 體積催化成核理論和表面誘發成核理論

M. Toner等[11]在1991年提出了體積催化成核理論和表面誘發成核理論。觀察了小鼠卵母細胞在120 ℃/min降溫速率下的胞內冰形成情況，隨著溫度的降低，胞內冰的形成概率逐漸增加，且隨著溶液滲透壓的增加，胞內冰的形成溫度也不斷降低，當滲透壓升至735 mOsm/kg之后，胞內冰的形成曲線發生變化，當溫度達到-31 ℃時，曲線的斜率陡然增加，以-31 ℃為界線，溫度變化對胞內冰的形成有不同影響，表明在-31 ℃上下有兩種不同的胞內冰形成機制。假設溫度高于-31 ℃時，形成的胞內冰是由胞外冰催化形成的，胞內冰形成的溫度較高；溫度低于-31 ℃時，形成的胞內冰的晶核來自細胞內部，需要的溫度更低，可能是細胞內的物質或細胞結構作為晶核異相成核，或者是細胞內部的過冷水勻相成核，細胞內部成核使在極短的溫度區間內胞內冰的形成概率達到100%。

M. Toner等[11]還觀察到存在兩種不同類型的胞內冰，在沒有加入保護劑的情況下，前者發生的溫度較高，高于-17 ℃，表現為細胞在光學顯微鏡下變黑；后者的形成溫度低于-24 ℃，表現為細胞照片的灰度沒有變化，在靜止的照片上無法區分，但在運動的影像上很容易區分，在兩種類型的胞內冰中間存在一個溫度區間-24～-17 ℃，在該區間內兩種類型的胞內冰同時存在。中間過渡區域不涉及以-31 ℃為分界點的胞內冰生成機制的轉變。出現該現象的原因可能是細胞的內冰晶分支的大小不同，取決于細胞質的過冷程度。但M. W. Scheiwe等[21]通過研究人粒細胞，認為變黑類型的胞內冰是異相成核的結果，由胞外冰引發；灰度不變的胞內冰是胞內顆粒異相成核的結果。

M. Toner等[22]認為胞內冰晶生長存在兩種機制，如圖3所示，在-31 ℃以上為表面誘發成核。胞外冰晶的形成會產生一些影響細胞膜的因素，如化學、電、機械、離子或熱量等，而細胞膜受影響后產生的變化會間接地促使胞內冰在細胞膜內表面上形成，此過程從胞外到胞內沒有傳質過程。

圖3 SCN理論Fig.3 SCN theory

如圖4所示，在-31 ℃以下為體積催化成核，晶核來自細胞內部，可能是細胞內部存在的一些結構或生物大分子引發的胞內異相成核，或是胞內水分子的勻相成核。

圖4 VCN理論Fig.4 VCN theory

M. Toner等[22]給出兩種理論的數學模型：

(5)

式中：PIF為胞內冰的生成概率；B=(-?T/?t)；As為發生成核的細胞膜區域。

(6)

式中：Ωhet和Khet分別為冰晶成核的動力學和熱力學參數。

(7)

(8)

(9)

式中：θ為胞內冰晶形成時和細胞膜的接觸角，取決于溶液和細胞膜基質、冰相和細胞膜基質及冰水界面三者之間的界面能。對于在滲透壓為285 mOsm/kg，降溫速率為120 ℃/min的小鼠卵母細胞的SCN模型，Ω0SCN=3.56×108(m25s)-1，K0SCN=4.60×109K5，接觸角為35°，結果顯示胞內冰形成溫度區間在-10 ℃左右。對于在滲透壓為1035 mOsm/kg，降溫速率為120 ℃/min的小鼠卵母細胞的VCN模型，Ω0VCN=1.84×1050(m25s)-1，K0VCN=1.08×1012K5，對應的胞內冰生成溫度在-31 ℃左右。模型擬合數據與實驗數據相符。

M. Toner等[22]的胞內冰形成模型被運用在多種細胞保存的理論研究當中。張紹志等[23]利用M. Toner等[22]的胞內冰形成模型研究了臍帶血干細胞的凍存特性，降溫速率為30 ℃/min，并且采用人工置核引發胞外冰，發現臍帶血干細胞在沒有添加低溫保護劑的情況下，細胞處于0.09%的等滲溶液中時，降溫過程中胞內冰的生成溫度為-13～-4 ℃，認為是細胞膜內表面催化引起的胞內冰，根據實驗擬合得到的Ω0SCN=1.31×109(m25s)-1，K0SCN=2.22×108K5。當加入10%的二甲基亞砜作為低溫保護劑時，胞內冰的生成溫度為-38～-27 ℃，認為這是細胞內部組分異相成核VCN引起的。劉寶林等[24]對小鼠成骨細胞的胞內冰形成情況進行了研究，降溫速率為400 ℃/min，胞內冰生成溫度為-20～-4 ℃，并且在-10 ℃時包內冰發生的概率顯著增大。易靜如等[25]觀察了子宮頸癌細胞在45 ℃/min和60 ℃/min降溫速率下的胞內冰成核情況，利用SCN模型擬合得到了相關的動力學和熱力學參數。

M. Toner等[22]的理論模型被用在多種細胞的低溫保存過程中，驗證了正確性，但還缺乏直接實驗證據。在SCN理論中細胞膜是如何引發胞內異相成核的仍是未知，猜想的化學、電、機械、離子或熱量等因素還需要逐項研究；在VCN理論中細胞內部是如何成核的，關于細胞內部是否存在有效的成核介質需要進一步研究，如果是細胞內勻相成核，那么需要的條件更為苛刻。只有理想狀態下的純水才能形成勻相成核[9]，在細胞內部一個多組分的溶液體系里實現勻相成核的機機制也需要探討。

1.5 膜受損理論

1990年K. Muldrew等[9]以小鼠成纖細胞為研究材料，得出膜受損理論。研究發現胞內冰的形成溫度和降溫速率無關，而與保護劑的質量摩爾濃度相關，結果顯示小鼠成纖維細胞在降溫速率50～200 ℃/min的溫度區間內時，改變降溫速率對胞內冰的形成溫度沒有顯著性差異，根據P. Mazur[10]的孔理論，形成胞內冰需要足夠快的降溫速率使冰晶能通過細胞膜上的通道生長，而實驗結果顯示胞內冰形成和降溫速率無關，因而不支持孔理論。此外，K. Muldrew等[9]發現隨著溶液質量摩爾濃度的升高，形成胞內冰所需的冰水界面移動速率在降低。冰水界面的電勢隨著溶液質量摩爾濃度的升高而降低，隨著冰水界面移動速率的加快而上升，理論上提高溶液的質量摩爾濃度，需要更高的冰水界面移動速率以達到破壞細胞膜的對應的電勢。因此，K. Muldrew等[9]否定胞外冰形成移動時的冰水界面的電勢造成細胞膜損傷從而引發胞內冰的理論，還發現胞內冰的形成溫度隨著過冷度的增加而降低，否定了存在一個關鍵的過冷度點決定胞內冰產生的理論。

K. Muldrew等[9]在否定已有的假說的基礎上，提出細胞在降溫過程中會在細胞膜兩側形成一個滲透梯度，且該梯度存在一個臨界值，同時低溫會造成細胞膜結構的變化，在低溫下細胞膜流動性變差，變得更脆，這兩個因素綜合造成了細胞膜的損傷，細胞膜損傷之后，失去了對冰晶的屏障作用由此而形成胞內冰。他們選取整個體系中50%的細胞損傷時對應的細胞膜兩側滲透梯度為觀察對象，發現隨著胞內冰成核溫度的降低，細胞膜兩側的滲透梯度逐漸降低，且呈線性關系。根據該線性關系得出：在0 ℃時，由于低溫造成50%的細胞損傷率對應的細胞膜滲透梯度為9.11 MPa；將細胞直接置于0 ℃的溶液中，逐漸提高滲透壓，對應的50%細胞損傷時的滲透梯度為9.15 MPa，與前者相近，因此認為細胞在低溫保存過程中的損傷是由細胞膜兩側的滲透梯度造成的，胞內冰是細胞膜損傷的結果。此觀點與一般材料的抗張強度均為溫度的函數的解釋一致。他們還假設膜的損壞不一定與滲透壓本身有關，而與水分的運輸速率有關。

K. Muldrew等[9]通過實驗結合線性擬合研究胞內冰的方法很有借鑒意義，能有效找出影響胞內冰的因素，但實驗設置還存在一些問題，在質疑孔理論時，采用的降溫速率區間過高，沒有覆蓋低降溫速率區間，從而錯過了在低降溫速率區間細胞膜的屏障作用，而這點是支持P. Mazur[10]的孔理論的。

2 胞內冰的實驗觀察

觀察胞內冰晶的形成需要特殊的設備及方法，常用的儀器是低溫顯微鏡，電子顯微鏡及共聚焦顯微鏡。在顯微鏡的基礎上衍生出一系列觀察方法[26]：1)“閃光法”，胞內冰晶的散射會使整個細胞內部變黑，借以判斷胞內冰的形成；2)熒光法，利用熒光染料SYTO13TM對細胞內部的DNA以及RNA進行染色，胞內冰的生成會損壞細胞核以及胞質內的核酸，使細胞呈現一種蜂巢狀的熒光圖案；3)差示掃描量熱法，冰晶的形成會釋放結晶潛熱，根據降溫過程中的熱量變化側面反映胞內冰的生成情況。

2005年P. Mazur等[27]觀察了非洲爪蛙和小鼠的卵母細胞在降溫過程中的冰晶生長情況。他們指出，按照K. Muldrew等[9]的膜受損理論，在足夠快的降溫速率下，細胞內的水分運輸是溫度的函數而不受保護劑的質量摩爾濃度和種類的影響，但實驗發現胞內冰的生成溫度與保護劑的質量摩爾濃度和種類有很大關系，因此不支持K. Muldrew等[9]的膜受損理論。實驗進一步支持胞內冰是由胞外冰引起的，結合實驗結果，P. Mazur等[27]認為由胞外冰引起的細胞膜上孔結構的改變有可能和胞內冰的形成有關。

楊戈爾等[17，28]在細胞內的水生長可能是有方向的基礎上，通過高速攝像機直接觀察了胞內冰的生長過程。研究表明，在慢速降溫過程中，胞內冰是在靠近細胞核的細胞膜內側開始生長的，逐漸進入細胞核內，最后穿過細胞核，并在細胞核周圍停止生長，冰晶并未覆蓋整個細胞。這可能是由于細胞膜和核膜表面附近的水分子排列是有規律的[29]，而細胞核與細胞膜相距最近的胞質空間區域的水分子的排列相比于細胞的其他部分更為規律，更利于冰晶的生長。而冰晶的生長過程實際上就是水分子的定向排列成鍵過程。研究指出胞內冰是在細胞膜上發生的，但由于細胞內水分排列的不同而表現出發生位置的特異性。此外，冰晶生長進入細胞核而不是繞過細胞核，他們認為這是由于細胞核內部的水分含量更多造成的，細胞核內部分水分含量更高有兩個原因：1)在低溫下水分子的擴散更加緩慢；2)核膜的阻擋作用。這兩個假設還缺乏具體的實驗證明，如何確定在核膜與細胞膜之間的水分子排列更加規律，如何測量細胞核與胞質的水分含量，測量之后如何用實驗證明，這些問題都有待商榷。

2016年T. Ninagawa等[30]同樣利用高速攝像機觀察了天竺葵葉片背面的細胞在沒有加入低溫保護劑時的胞內冰生成情況，得到較為清晰的胞內冰形成圖像，研究發現胞內冰在植物葉片細胞中的形成模式分為3種：1)胞內冰在細胞膜內表面開始形成，然后沿著細胞四周生長;2)胞內冰在細胞膜內表面開始形成，然后向細胞中心生長；3)胞內冰在細胞中間而不是細胞膜內表面形成，然后向四周生長，該模式研究揭示了細胞內存在著有效的晶核。驗證了VCN理論的可行性。

3 復溫過程的胞內冰

復溫過程中的胞內冰是指經過低溫凍存或玻璃化保存的細胞在復溫過程中經歷的細胞內部的冰晶再生長過程。H. Bank[31]研究了低溫凍存的酵母細胞在慢速復溫下的胞內冰生長情況，結果顯示在慢速復溫過程中，細胞被復溫到-50 ℃保持24 h，細胞內部也只有小冰晶，當細胞被復溫到-30 ℃且維持30 min時，胞內出現部分大體積冰晶，當細胞被復溫到-20 ℃且只維持5 min時，胞內出現大量大體積冰晶。結合A. P. Maclenzie[32]對酵母細胞在復溫過程中細胞存活率的研究表明：復溫過程中的胞內冰相比于降溫過程中的胞內冰更為致命，胞內冰晶在由小冰晶生長到大冰晶的過程中對細胞造成的損傷更大。目前更傾向于在復溫階段使用快速復溫來解凍細胞，使細胞在復溫過程中快速通過危險溫區，從而避免胞內冰晶再生長對細胞產生的損害。利用交變磁場對磁納米粒子進行加熱[33]，此種加熱方式快速且均勻，被認為是復溫細胞最有效的手段。

4 水通道蛋白與胞內冰

一個生物體或器官由很多不同種類的細胞構成，若想實現整個機體或器官的低溫凍存，必須分別對不同類型的細胞進行研究。了解胞內冰在不同細胞內的生成機理并避免在凍結過程中的冰晶損傷對于整個機體或器官的保存至關重要。但由于采用不同的細胞進行研究，導致很多結論難以統一，經典假說的研究過程中采用不同物種的不同細胞進行研究，P. Mazur[10]采用微生物，M. Toner等[11]采用小鼠卵母細胞，K. Muldrew等[9]采用小鼠成纖細胞。盡管不同的細胞有不同的表現，但在整個過程中細胞膜和胞內水分含量是關鍵。

細胞膜上的水通道蛋白調控著水分的運輸，水通道蛋白于1988年被Arge發現并命名為CHIP28，并于1991[34]年被證實參與水分的運輸。其形成的通道直徑很小，只允許單個水分子通過，比如AQP1水通道蛋白形成的親水通道直徑約為0.28 nm[35]。研究表明水通道蛋白通過其內部特定氨基酸結構使水分子以適當的角度穿過通道到達細胞內部[34]，而這種使水分子有序排列的功能可以降低冰晶形成所需的能量使冰晶能在通道內部生長。

無毒水通道蛋白阻斷劑是一類可以阻斷水通道蛋白的試劑，一般是具有巰基活性的汞復合物被廣泛用于水通道蛋白的研究[36]。采用無毒水通道蛋白阻斷劑將細胞膜上面的水通道關閉，在低溫顯微鏡和DSC上觀察胞內冰的生成情況，通過低溫顯微鏡直接觀察胞內冰的形成情況。如果由于水通道蛋白的關閉引起冰晶無法穿過通道，造成胞內溶液過冷度提高，胞內冰形成溫度下降，證明水通道蛋白在胞內冰的形成過程中起了很重要的作用。利用DSC研究細胞的凍結過程，前人的研究顯示細胞在降溫過程中會出現兩個放熱峰，大的峰是細胞外溶液結晶的放熱峰，小的峰是胞內溶液凍結的放熱峰，如果水通道被阻斷后，胞內冰發生的熱事件后移，也表明水通道蛋白是胞外冰進入細胞內部的通道。可通過分子生物學手段，用基因敲除的辦法減少水通道蛋白的數量來研究水通道蛋白對胞內冰的影響。此外，可通過相應的模擬軟件對實驗無法進行的部分進行模擬計算。

圖5 冰晶無法通過關閉后的水通道生長Fig.5 Ice crystals can not grow through the closed water channel

如果胞內冰是由胞外冰通過水通道蛋白進入細胞內引發的，可以通過減少細胞膜表面的水通道蛋白的數量，減少胞內冰的發生概率，但同時降低水通道蛋白也會降低細胞對水分的運輸能力，所以在保存細胞前可對細胞進行適當脫水處理使細胞內部水分含量降低，再結合水通道蛋白數量的減少或關閉來抑制胞內冰的形成。此外，組織或器官中不同細胞的水分滲透能力不同，這也是組織或器官難以長期低溫保存的原因，通過修飾水通道蛋白使不同類型的細胞具有相同的水分滲透能力也許是解決組織或器官長期保存的有效方法。相反，利用增加水通道蛋白的數量增加胞內冰發生的概率，可用于低溫外科手術中以增加治療效果。

5 結論與展望

本文詳細分析了目前關于胞內冰形成的假說，現有假說都有相對應的實驗證據，但都是從側面進行驗證，由于采用不同的細胞進行研究，難以得到統一的結論。冰晶要在胞內形成，需要兩個條件：有效的晶核和足夠的自由水分子數。圍繞晶核的來源衍生出的孔理論、SCN理論、VCN理論都能解釋對應的實驗結果。目前的實驗觀測到細胞內部存在有效的晶核，說明VCN理論是可行的。關于孔理論和SCN理論，區分這兩個假說是研究的關鍵。對于孔理論存在的問題是：細胞膜上的水通道蛋白能否作為冰晶生長的通道；對于SCN理論存在的問題是：細胞膜內表面如何催化冰晶形成，如何界定細胞膜催化冰晶形成的能力。圍繞這些問題需要仔細地設計實驗進一步研究。

本文受上海東方學者跟蹤計劃項目的資助。(The project was supported by the Project Tracing Program of Oriental Scholars.)

[1] HEO Y S, NAGRATH S, MOORE A L, et al. “Universal” vitrification of cells by ultra-fast cooling[J]. Technology, 2015, 3(1):64-71.

[2] MACFARLANE D R. Physical aspects of vitrification in aqueous solutions[J]. Cryobiology, 1987, 24(3):181-195.

[3] HUANG H, CHOI J K, RAO W, et al. Alginate hydrogel microencapsulation inhibits devitrification and enables large-volume low-CPA cell vitrification[J]. Advanced Functional Materials, 2015, 25(44):6939.

[4] LIU Baolin, JOHN M. Freezing osteoblast cells attached to hydroxyapatite discs and glass coverslips: mechanisms of damage[J]. Science in China Series E(Technology Sciences), 2007, 50(2):248-256.

[5] 郝保同, 劉寶林, 林萍, 等. 冰晶對黏附成骨細胞損傷的實驗研究[J]. 制冷學報, 2010, 31(1):59-62. (HAO Baotong, LIU Baolin, LIN Ping, et al. Damage of extracellular ice to attached osteoblast cell during cryopreservation[J]. Journal of Refrigeration, 2010, 31(1):59-62.)

[6] 梁瑋, 姚嵐, 劉寶林. 低溫保存對Hep-G2細胞凋亡的影響[J]. 制冷學報, 2017, 38(1):113-118. (LIANG Wei, YAO Lan, LIU Baolin. Effect of cryopreservation on apoptosis in Hep-G2 cells[J]. Journal of Refrigeration, 2017, 38(1):113-118.)

[7] HOFFMANN N E, BISCHOF J C. The cryobiology of cryosurgical injury[J]. Urology, 2002, 60(2):40-49.

[8] MAZUR P, LEIBO S P, CHU E H Y. A two-factor hypothesis of freezing injuryevidence from Chinese hamster tissue culture cells[ J]. Experimentak Cell Research, 1972, 71(2):345-355.

[9] MULDREW K, MCGANN L E. Mechanisms of intracellular ice formation[J]. Biophysical Journal, 1990, 57(3):525-532.

[10] MAZUR P. Physical factors implicated in the death of microorganisms at subzero temperatures[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1960, 85:610-629.

[11] TONER M, CRAVALHO E G, KAREL M. Thermodynamics and kinetics of intracellular ice formation during freezing of biological cells[J]. Journal of Applied Physics, 1990, 67(3):1582-1593.

[12] 華澤釗, 任禾盛. 低溫生物醫學技術[M]. 北京:科學出版社,1994:23-25. (HUA Zezhao, REN Hesheng. Technology of cryobiology and medical[M]. Beijing: Science Press, 1994:23-25.)

[13] 陶樂仁, 華澤釗. 低溫保護劑溶液結晶過程的顯微實驗研究[J]. 工程熱物理學報, 2001, 22(4):481-484. (TAO Lereng，HUA Zezhao. A microscopic study of the crystallization in cryoprotectent agents[J]. Journal of Engineering Thermophysics, 2001, 22(4):481-484.)

[14] BOUTRON P, MEHL P, KAUFMANN A, et al. Glass-forming tendency and stability of the amorphous state in the aqueous solutions of linear polyalcohols with four carbons: I. Binary systems water-polyalcohol[J].Cryobiology,1986, 23(5): 453-469.

[15] MAZUR P. Cryobiology: the freezing of biological systems[J]. Science, 1970, 168(3934):939-949.

[16] 王雅博, 諸凱, 安娜, 等. 不同降溫速率對腎細胞內、外冰形成溫度的影響[J]. 低溫工程, 2012(3):62-66. (WANG Yabo, ZHU Kai, AN Na, et al. Effect of different cooling rate on ice formation temperature of intra-and-extracellular[J]. Cryogenics, 2012(3):62-66.)

[17] 楊戈爾.低溫冷凍過程中胞內冰晶生長機制與應用研究[D]. 上海:上海交通大學, 2011. (YANG Ge′er. Mechanistic study of intracellular ice formation and application[D]. Shanghai: Shanghai Jiao Tong University, 2011.)

[18] MAZUR P. The role of cell membrane in the freezing of yeast and other single cells[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1965, 125(2):658-676.

[19] BERGER W K, UHRIK B. Freeze-induced shrinkage of individual cells and cell-to-cell propagation of intracellular ice in cell chains from salivary glands[J]. Experientia, 1996, 52(9):843-850.

[20] ACKER J P, ELLIOTT J A,MCGANN L E. Intercellular ice propagation: experimental evidence for ice growth through membrane pores[J]. Biophysical Journal, 2001, 81(3):1389-1397.

[21] SCHEIWE M W, KORBER C. Quantitative cryomicroscopic analysis of intracellular freezing of granulocytes without cryoadditive[J]. Cryobiology, 1987, 24(5):473-483.

[22] TONER M, CRAVALHO E G, KAREL M. Thermodynamics and kinetics of intracellular ice formation during freezing of biological cells[J]. Journal of Applied Physics, 1990, 67(3):1582-1593.

[23] 張紹志, 王葳, 陳光明, 等. 低溫顯微裝置及其對細胞胞內冰晶形成現象的觀察[J]. 中國細胞生物學學報, 2003, 25(4):231-234. (ZHANG Shaozhi，WANG Wei，CHEN Guangming, et al. Cryomicroscope and its use in the observation of intracellular ice[J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2003, 25(4):231-234.)

[24] 劉寶林,MCGRATH John, 華澤釗. 低溫保存過程中老鼠成骨細胞胞內冰的研究[J]. 制冷學報, 2007, 28(1):22-25. (LIU Baolin, MCGRATH John，HUA Zezhao. Intracellular ice formation of mouse obseoblasts during cryopreservation[J]. Journal of Refrigeration, 2007, 28(1):22-25.)

[25] 易靜如, 賈異之, 趙剛. HeLa細胞胞內冰成核現象實驗研究[J].工程熱物理學報, 2015(2):380-382. (YI Jingru, JIA Yizhi, ZHAO Gang. Experimental study on intracellular ice nucleation in HeLa cells[J]. Journal of Engineering, 2015(2):380-382.)

[26] ACKER J P, CROTEAU I M. Pre- and post-thaw assessment of intracellular ice formation[J]. Journal of Microscopy, 2004, 215(Pt 2):131-138.

[27] MAZUR P, SEKI S, PINN I L, et al. Extra- and intracellular ice formation in mouse oocytes[J]. Cryobiology, 2005, 51(1):29-53.

[28] BISCHOF J C, RUBINSKY B. Large ice crystals in the nucleus of rapidly frozen liver cells[J]. Cryobiology, 1993, 30(6):597-603.

[29] CHENG J X, PAUTOT S, WEITZ D A, et al. Ordering of water molecules between phospholipid bilayers visualized by coherent anti-stokes raman scattering microscopy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(17):9826-9830.

[30] NINAGAWA T, EGUCHI A, KAWAMURA Y, et al. A study on ice crystal formation behavior at intracellular freezing of plant cells using a high-speed camera[J]. Cryobiology, 2016, 73(1):20-29.

[31] BANK H. Visualization of freezing damage. II. Structural alterations during warming[J]. Cryobiology, 1973, 10(2):157-170.

[32] MACKENZIE A P. Death of frozen yeast in the course of slow warming[J]. Cryobiology, 1973, 10:157-170.

[33] 王建業. Fe3O4納米顆粒對細胞低溫保存過程傳遞現象的影響及其應用[D]. 合肥:中國科學技術大學, 2015. (WANG Jianye. Effect of Fe3O4nanoparticles on biotransport and its application in cryopreservation[D]. Hefei: University of Science and Technology of China, 2015.)

[34] AGRE P, PRESTON G M, SMITH B L, et al. Aquaporin CHIP: the archetypal molecular water channel[J]. American Journal of Physiology, 1993, 265(2):463-476.

[35] 王晶, 桑建利. 水通道蛋白的基本結構與特異性通透機理[J]. 生物學通報, 2011, 46(2):19-22. (WANG Jing, SANG Jianli. The basic structure and specific permeability mechanism of aquaporins[J]. Bulletin of Biology, 2011, 46(2):19-22.)

[36] KOSINSKA E U, FISCHER G, FRIEMANN R, et al. Subangstrom resolution X-ray structure details aquaporin-water interactions[J]. Science, 2013, 340(6138):1346-1349.

[37] HASEGAWA H, MA T, SKACH W, et al. Molecular cloning of a mercurial-insensitive water channel expressed in selected water-transporting tissues[J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(8):5497-5500.

[38] SEKI S, MAZUR P. Kinetics and activation energy of recrystallization of intracellular ice in mouse oocytes subjected to interrupted rapid cooling[J]. Cryobiology, 2008, 56(3):171-180.

[39] MAZUR P, KOSHIMOTO C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates[J]. Biology of Reproduction, 2002, 66(5):1485-1490.

[40] MAZUR P, COLE K W. Influence of cell concentration on the contribution of unfrozen fraction and salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes[J]. Cryobiology, 1985, 22(6):509-536.

[41] PEGG D E. The relevance of ice crystal formation for the cryopreservation of tissues and organs[J]. Cryobiology, 2010, 60(Suppl. 3):36-44.

[42] ACKER J P, MCGANN L E. Membrane damage occurs during the formation of intracellular ice[J]. Cryo Letters, 2001, 22(4):241-254.

[43] MORRIS G J. Rapidly cooled human sperm: no evidence of intracellular ice formation[J]. Cryobiology, 2006, 53(3):2075-2083.