PPFIA1在頭頸部鱗癌中的表達(dá)及預(yù)后意義

周宏　李文平　裴斐　吳剛

頭頸部惡性腫瘤主要病理類型為鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC），具有高發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康。從解剖位置上包括鼻咽癌、口咽癌、下咽癌、口腔癌和喉癌[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全世界有50萬(wàn)HNSCC新患者被發(fā)現(xiàn)[2]。研究證實(shí)，HNSCC發(fā)生與煙草、酒精及人類乳頭狀病毒感染密切相關(guān)[3]。目前，早期HNSCC治療主要以手術(shù)和放化療為主，晚期HNSCC以多學(xué)科綜合治療為主。盡管治療手段的多樣性，但患者的生存率還是比較低。越來(lái)越多的研究表明，分子標(biāo)志物的檢測(cè)可以評(píng)估頭頸部腫瘤的預(yù)后。

PPFIA基因家族包括PPFIA1，PPFIA2，PPFIA3，PPFIA4。其基因家族成員在人體內(nèi)具有不同的生理功能，在各種不同惡性腫瘤中均有不同程度的表達(dá)，直接參與惡性腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[4]。PPFIA1在20%的乳腺癌中高表達(dá)，影響人乳腺細(xì)胞的遷移與侵襲功能[5]。PPFIA2作為一種近視進(jìn)展的分子機(jī)制也得到較大的關(guān)注[6]。PPFIA3基因甲基化可作為一種分子標(biāo)志物來(lái)評(píng)估胃癌的發(fā)生發(fā)展[7]。PPFIA4在心臟、腦、骨骼肌肉中均有不同程度的表達(dá)[8]。因此，本研究進(jìn)一步探討PPFIA基因家族在HNSCC中的表達(dá)情況，分析PPFIA1在HNSCC中的表達(dá)及預(yù)后意義。

1　材料和方法

1.1　從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(www.oncomine.org)是一個(gè)癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，主要提供腫瘤基因的相關(guān)信息，可以呈現(xiàn)可視化結(jié)果。本研究設(shè)定篩選條件，具體如下：（1）Gene：PPFIA1；（2）Cancer Type：Head and Neck Cancer；（3）Data Type：mRNA；（4）Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis。通過(guò)選擇PPFIA家族成員在癌組織與正常對(duì)照組織之間表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系、P值來(lái)顯示結(jié)果，分析在mRNA水平上PPFIA家族成員在頭頸部鱗癌與正常黏膜組織表達(dá)的差異性。

MA 是一類由微生物產(chǎn)生的、分子內(nèi)含有大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的生物活性物質(zhì)，其根據(jù)分子中內(nèi)酯鍵的數(shù)量不同有大環(huán)一內(nèi)酯至大環(huán)多內(nèi)酯多種結(jié)構(gòu)；另按照內(nèi)酯環(huán)的大小又可分為十二元環(huán)、十四元環(huán)、十五元環(huán)等，目前最大可至六十元環(huán)。除以上一般分類的 MA 外，還有多烯大環(huán)內(nèi)酯、安莎大環(huán)內(nèi)酯與酯肽等。

1.2　從cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)（www.cbioportal.org）整合了癌癥基因圖譜（TCGA）和國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟（ICGC）等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，主要提供癌癥基因組數(shù)據(jù)、綜合分析基因組數(shù)據(jù)和臨床資料等。檢索cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)，依次勾選Head and Neck；Head and Neck Squamous cell carcinoma（TCGA, Provisional）；mRNA Expression z-Scores（RNA Seq V2 RSEM）， 輸 入 基 因 PPFIA1， 獲 得 與PPFIA1基因相關(guān)的數(shù)據(jù)，分析PPFIA1 mRNA在HNSCC中的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。

1.3　RT-PCR方法檢測(cè)PPFIA1 mRNA在喉鱗癌中的表達(dá)情況

病例標(biāo)本來(lái)源于2017年1-11月在復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院接受手術(shù)的26例喉癌患者，其中男24例，女2例；年齡42～75歲。術(shù)前未行放化療，術(shù)后組織病理診斷均為喉鱗狀細(xì)胞癌，為原發(fā)腫瘤。術(shù)中快速將配對(duì)的癌組織和癌旁新鮮組織標(biāo)本裝在2 ml凍存管中，標(biāo)記后快速放進(jìn)液氮罐，在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol法提取喉癌組織及正常對(duì)照組織的總RNA。用Qiagen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板在ABI ViiA7實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行后續(xù)熒光定量PCR反應(yīng)。引物購(gòu)置生工生物工程（上海）股份有限公司，PPFIA1基因及內(nèi)參的引物序列如下：引物：PPFIA1上游5'-ACCAAAGGACATTCGTGGCT-3'，下 游5'-AAAGCTGCTCATGCTCCCA-3'。GAPDH引 物： 上 游5'-TGCCCTCAACGACCACTTT-3'， 下 游 5'–GGTCCAGGGGTCTTAC TCCTT-3'。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，以2-△△Ct法分析癌組織中PPFIA1的表達(dá)相對(duì)于正常對(duì)照組織中的變化倍數(shù)，以此表示目的基因PPFIA1的相對(duì)表達(dá)量。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，喉鱗癌組織與正常組織對(duì)照中PPFIA1 mRNA表達(dá)差異用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　PPFIA家族成員在頭頸部鱗癌中的表達(dá)特征

通過(guò)檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了PPFIA家族成員在HNSCC中的表達(dá)特征。在Ginos數(shù)據(jù)集中，PPFIA1 mRNA表達(dá)在頭頸部鱗癌（41例）較正常黏膜（13例）高2.252倍（P=1.76E-8），見(jiàn)圖1。PPFIA2 mRNA、PPFIA3 mRNA、PPFIA4 mRNA分別在頭頸部鱗癌組織與正常對(duì)照黏膜組織中表達(dá)無(wú)顯著差異（PPFIA2：-1.468倍，P=0.952；PPFIA3：-1.436倍，P=0.974；PPFIA4：-1.260倍，P=0.917），見(jiàn)圖2、3、4。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，PPFIA1 mRNA表達(dá)在喉鱗癌組織較喉黏膜正常組織表達(dá)顯著上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），見(jiàn)圖5。

2.2　PPFIA1表達(dá)與頭頸部鱗癌患者的相關(guān)性

通過(guò)檢索cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)（TCGA，Provisional），收集530例樣本PPFIA1基因表達(dá)數(shù)據(jù)，按照表達(dá)高低分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析PPFIA1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性，得出Kaplan-Meier生存曲線。結(jié)果顯示，PPFIA1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)的總生存率（OS）有顯著差異（P=0.026），見(jiàn)圖6。

圖2　頭頸部鱗癌與正常對(duì)照組織中PPFIA2 mRNA表達(dá)的差異性（Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)）

圖3　頭頸部鱗癌與正常對(duì)照組織中PPFIA3 mRNA表達(dá)的差異性（Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)）

圖4　頭頸部鱗癌與正常對(duì)照組織中PPFIA4 mRNA表達(dá)的差異性（Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)）

3　討論

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）是世界第6大常見(jiàn)的好發(fā)腫瘤[9]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，61%的HNSCC患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，高達(dá)26%的患者發(fā)展為遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移[10]。盡管HNSCC患者有多種治療方法：手術(shù)、放化療、靶向治療、免疫治療等，但患者5年OS仍不高，為40%，復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成為預(yù)后差和致死的主要原因[11]。研究表明，HNSCC的發(fā)生發(fā)展與許多重要的癌基因發(fā)生突變及表達(dá)異常密切相關(guān)[12]。因此，尋找一種分子標(biāo)志物對(duì)評(píng)估HNSCC患者預(yù)后有非常重要的作用。

PPFIA1基因定位于染色體11q13擴(kuò)增區(qū)，屬于LAR蛋白酪氨酸磷酸酶連接蛋白家族。PPFIA1能與LAR蛋白酪氨酸磷酸酶受體在粘著斑處相互作用，增強(qiáng)細(xì)胞的移動(dòng)[13]。PPFIA1在多種惡性腫瘤中都是高表達(dá)的。有研究報(bào)道，PPFIA1基因在乳腺癌細(xì)胞系中細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲發(fā)揮重要的作用，且與患者預(yù)后相關(guān)，可作為評(píng)估乳腺癌患者的一種潛在分子標(biāo)志物[4]。PPFIA1蛋白能與ING4相互作用，增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。此外，PPFIA1在不同腫瘤中的功能多樣性可能與它相連接的蛋白不同有關(guān)[15]。

圖5　喉癌和正常喉黏膜組織中PPFIA1 mRNA表達(dá)的差異性

圖6　PPFIA1表達(dá)與HNSCC患者預(yù)后的相關(guān)性（cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)）

本研究通過(guò)挖掘Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析了PPFIA家族成員分別在頭頸部鱗癌和正常對(duì)照黏膜的差異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PPFIA1在頭頸部鱗癌中的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照黏膜，通過(guò)對(duì)臨床喉癌組織標(biāo)本的RT-PCR檢測(cè)，也證實(shí)了這一點(diǎn)。而其它家族成員在頭頸部鱗癌中的表達(dá)水平與正常對(duì)照黏膜無(wú)明顯差異。同時(shí)，通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PPFIA1高低表達(dá)與患者預(yù)后顯著相關(guān)，PPFIA1高表達(dá)患者，預(yù)后較差。因此，在HNSCC中，PPFIA1通過(guò)一定的機(jī)制影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究報(bào)道了PPFIA1在頭頸部鱗癌中的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組織，PPFIA1高表達(dá)的患者生存期較短，預(yù)后較差。因此有必要進(jìn)一步研究其作用于腫瘤的機(jī)制，對(duì)改善患者預(yù)后的研究具有一定的理論指導(dǎo)意義。