益氣潤目湯對干眼小鼠眼表組織IL-1β及P-JNK表達的影響

張月 ，亢澤峰 ，劉健 ，劉彥江

干眼是多種因素、多環(huán)節(jié)共同參與的病理過程。有研究表明高滲、干燥等環(huán)境能激活角結膜上皮絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase,MAPK）（尤其是 p38/P-JNK）通路，進一步促進多種促炎因子如白細胞介素（IL-1α、IL-1β、IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α,TNF-α）、基質金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases,MMPs）等的分泌，局部炎癥反應放大，損害局部角結膜組織及正常的淚液分泌，影響淚液分泌的質和量，引發(fā)干眼[1-3]。通過免疫調節(jié)和抗炎治療干眼具有較好的前景。

自擬益氣潤目湯是以黃芪、當歸為主的中藥組方。前期臨床研究中我們將中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院收治符合干眼診斷標準的113例患者，隨機分為治療組和對照組，治療組59例（109只眼），對照組54例（104只眼）。治療組采用益氣潤目湯內服聯(lián)合外部熏蒸治療干眼，對照組采用單純局部滴用玻璃酸鈉滴眼液治療。根據(jù)主觀癥狀和基礎淚液分泌試驗、淚膜破裂時間、角膜熒光素鈉染色等檢查進行評分，治療觀察4周。證實益氣潤目湯內服聯(lián)合局部熏蒸對干眼具有明顯治療效果，不僅能改善患者眼部不適，且能改變干眼所致的病理改變，能延緩及促進損傷眼表組織的修復。但其機制并不明確，因此結合目前炎癥在干眼發(fā)病中的作用，本實驗試圖驗證該方是否是通過抑制眼表炎癥相關因子的表達，從而達到保護眼表屏障、穩(wěn)定淚膜、治療干眼的效果，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料及方法

1.1 主要試劑及材料

SPF級Balb/c健康小鼠，鼠齡6～8周，雌性，體質量18～22 g，購自于北京芳元緣養(yǎng)殖場[SCXK（京）2009-0017]。氯化鈉粉劑、0.9%的氯化鈉注射液、酚紅棉線、5%熒光素鈉溶液、Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司，Lot No-1416528）、Taq 酶（北京 Promega 公司，M166BS）、兔抗多克隆抗體白細胞介素-1β（IL-1β）（武漢博士德生物技術有限公司）、磷酸化氨基末端蛋白激酶（P-JNK）抗體（博奧森 bs-1640R，Lot140224）、聚合辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔IgG（武漢博士德生物技術有限公司）、免疫組化檢測試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司，Lot No-09D04A）、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）、中性樹膠（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）。

1.2 藥物

益氣潤目湯（黃芪36 g、當歸10 g、淡竹葉10 g、蟬蛻 6 g、谷精草 10 g、金銀花 10 g、山茱萸 18 g、升麻6 g），購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，低、中、高劑量組按人與動物用藥換算表配置。玻璃酸鈉滴眼液（德國EUSAN GmbH公司，生產(chǎn)批號281053）。高滲鹽水配置[5]：用0.9%氯化鈉溶液加氯化鈉粉劑配制成500 mOsmol/L氯化鈉溶液。

1.3 動物造模、分組及給藥

依據(jù)李晶等[6]使用高滲鹽水建立干眼小鼠模型的方法造模。于實驗第0天除空白組外，各組均使用高滲鹽水點雙眼，每日5次（8時、10時、13時、15時、17時），點藥14 d。檢查小鼠造模后的淚液分泌、角膜熒光素染色情況，以確定是否造模成功。誘導失敗者剔除出組，成功誘導的干眼小鼠，采用隨機數(shù)字表的方法，隨機分組，模型組繼續(xù)點眼14 d，方法同前，維持干眼狀態(tài)，中藥高、中、低劑量組（0.754 g·ml-1，0.377 g·ml-1，0.188 g·mL-1） 給予高滲鹽水點眼聯(lián)合益氣潤目湯中藥顆粒劑灌胃，西藥組給予高滲鹽水聯(lián)合玻璃酸鈉滴眼液點雙眼 （每日4次，1滴/次）干預14 d。空白對照組等量生理鹽水灌胃14 d。

1.4 觀察IL-1β、P-JNK表達的方法

分別于治療后第7天、第14天，每組取6只小鼠，處死后將彎鑷從外眥部垂直探入，至眼球下方夾住視神經(jīng)，平行向上提起，摘除眼球，石蠟包埋包括角、結膜組織的完整的眼部組織，切片，備用，行免疫組化，陽性表達情況用Image-proplus 5.1圖像分析軟件進行免疫組化圖像分析，計算IL-1β、P-JNK表達的平均光密度值；同時間點，各組剩余4只小鼠，同上法摘取眼球后，剪除后節(jié)部分，保留角膜結膜等眼表組織稱重，按照Trizol說明書法提取角結膜組織的RNA，行反轉錄聚合酶鏈反應 （reverse tran-scription PCR,RT-PCR）檢測眼表組織中IL-1βmRNA的水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析比較同一時間點不同組間IL-1β、P-JNK表達的差異，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 角膜IL-1β、P-JNK表達的檢測

在 400倍光學顯微鏡下觀察，角膜 IL-1β、P-JNK表達成棕黃或黃色，空白對照組見少量表達（圖 1，圖 2），干眼模型組小鼠的 IL-1β、P-JNK 有顯著增高。治療7d及14d各治療組IL-1β、P-JNK表達均低于模型組（P＜0.05），中藥中劑量組的數(shù)值在三個劑量組中最低，與同期西藥組有統(tǒng)計學意義的差異（P＜0.05），結果詳見表 1、表 2。

表1 各組小鼠治療后不同時間角膜組織中IL-1β表達的光密度值比較（xˉ±s）

表2 各組小鼠治療后不同時間角膜組織中P-JNK表達的的光密度值比較（xˉ±s）

2.2 PCR檢測角結膜IL-1βmRNA表達水平

凝膠成像系統(tǒng)下見到目的基因和內參基因條帶如圖3所示，IL-1βmRNA在各組中均有表達，目的條帶IL-1β位于273 bp、管家基因β-actin條帶位于364 bp。 治療 7 d、14 d，各治療組 IL-1βmRNA 表達水平較干眼模型組明顯減少（P＜0.05），但高于空白對照組。結果詳見表3。

表3 各組小鼠治療后不同時間角結膜上皮中IL-1βmRNA的相對表達比較（xˉ±s，IL-1β mRNA/β-actin mRNA）

圖1 免疫組化檢測IL-1β在角膜組織中 的表達（×40）。1A.空白對照組，1B.干眼模型組，1C.益氣潤目湯中劑量組 IL-1β：白細胞介素-1β 圖2 免疫組化檢測P-JNK在角膜組織中的表達（×40）。 2A.空白對照組，2B.干眼模型組，2C.益氣潤目湯中劑量組 P-JNK：磷酸化氨基末端蛋白激酶

圖3 各組小鼠治療后不同時間角結膜組織中β-actin mRNA及IL-1βmRNA表達的電泳圖。A.空白對照組，B.干眼模型組，C.益氣潤目湯高劑量組，D.益氣潤目湯中劑量組，E.益氣潤目湯低劑量組，F(xiàn).玻璃酸鈉滴眼液組 IL-1β：白細胞介素-1β

3 討論

干眼是一種常見的眼表疾病，目前主要采用局部人工淚液替代、抗炎、免疫抑制劑、局部物理療法及手術治療等，但遠期療效不理想。中醫(yī)注重整體觀念，采用辨證論治理論，因人因時因地制宜，通過對人體臟腑功能的調節(jié)及外邪內熱的祛化，不僅能改善臨床癥狀，更能從根本上達到治愈效果。

近些年關于本病的病因及機制研究屢見不鮮，治療方面也改變了傳統(tǒng)的對癥治療，開始重視對病因的把握，注重從發(fā)病機制著手尋求更科學的治療方案。目前眾多醫(yī)家傾向于“炎癥是其發(fā)病的關鍵因素[7]，淚膜穩(wěn)定性下降是其發(fā)病的共同通道”這一說法，且此類炎癥是非感染性免疫相關炎癥。抗炎被納入干眼治療規(guī)范。近日在美國波士頓召開的美國白內障與屈光手術協(xié)會的年會（ASCRS）上，一種名為EBI-005的新型IL-1受體拮抗劑受到參會專家的關注。報告稱IL-1在疾病引發(fā)的炎癥反應中起著關鍵作用，包括干眼。

部分醫(yī)家經(jīng)過觀察，發(fā)現(xiàn)干眼患者淚液和結膜上 皮 中 的 多 種 細 胞 因 子 包 括 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TGF-β的水平較正常人有顯著改變，且與干眼的嚴重程度相關[7]。IL-1是一種重要的炎癥介質，主要有兩種前體形式（IL-α 和 IL-β），具有多種生物學功能。IL-1是IL-6和TNF-α等其他炎癥因子的強力誘導物，能夠通過多種機制擴大固有的免疫應答；同時IL-1與TNF-α能促進金屬基質蛋白酶MMPs（MMP-9，MMP-1，MMP-13）在角膜上皮中的表達，通過降解細胞外基質、參與組織重構、解除細胞間的黏附及促進炎癥細胞間的遷移而破壞角膜屏障及淚膜的穩(wěn)定性[8-10]，影響淚液的質、量，促使干眼發(fā)生。若能有效抑制炎癥因子的表達，在一定程度上就可達到保護眼表屏障（角結膜組織完整），保證淚液的分泌，終止干眼進程的效果。

本研究所用的益氣潤目湯，主要由黃芪、當歸、山茱萸、淡竹葉、金銀花、蟬蛻、升麻、谷精草共8味藥組成，臨床上加減化裁。現(xiàn)代醫(yī)學研究證實黃芪可明顯增強機體非特異性免疫功能，調節(jié)細胞免疫和體液免疫，是一種很有活力的雙向免疫調節(jié)劑，在免疫性疾病的治療方面有一定效果，既能預防超敏反應性疾病的發(fā)生，又可調整自身免疫病患者的免疫應答。能顯著下調TNF-α的mRNA基因表達，降低血漿中TNF-α水平，并使超氧化物歧化酶（SOD）合成增多，從而對組織細胞起到保護作用[4]。當歸[5]有抗炎、清除氧自由基、保肝利膽、保護腎臟、增強免疫功能等作用。

前期的臨床及實驗研究證實自擬益氣潤目湯的療效[11]，明顯提高了淚液的質與量，穩(wěn)定淚膜，但其機制并不明確，我們采用的高滲鹽水誘導干眼模型，操作方便，能保證眼球組織完整的前提下模擬人類干眼的體征及病理改變，從分子基因水平研究益氣潤目湯可能的機制。

通過本研究表明，正常角結膜組織中炎癥相關因子的含量低，當外界環(huán)境遭到破壞（干燥、滲透壓升高）或角膜屏障失去完整結構，炎癥因子效應會逐級增大，擴大局部反應，致使淚膜穩(wěn)定性下降，發(fā)生干眼。本研究PCR及免疫組化結果顯示，給予益氣潤目湯治療后角結膜組織中炎癥相關因子IL-1β、P-JNK表達有明顯下降，且中劑量組下降明顯優(yōu)于其他組，說明該方可能通過抑制角結膜組織中的炎性因子表達，減輕局部炎癥反應，保護眼表屏障完整，維護淚液分泌的質與量，達到治療干眼的效果。本研究中的中藥制劑是否可以影響眼表細胞的凋亡，各炎癥因子之間的關系是否存在協(xié)同或對抗，是否對激素、神經(jīng)傳導存在作用等，需要我們進一步研究。

[1] Li DQ,Chen Z,Song XJ,et al.Stimulation of matrix metalloproteinases by hyper-osmolarity via a JNK pathway in human corneal epithelial cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(12):4302-4311.

[2] Luo L,Li DQ,Doshi A,et al.Experimental dry eye stimulates production of inflammatory cytokines and MMP-9 and activates MAPK signaling pathways on the ocular surface[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(12):4293-4301.

[3] 侯樂,謝立科,張明明.炎癥和抗炎治療與干眼的關系[J].中國中醫(yī)眼科雜志,2010,20(5):307-309.

[4] 劉啟,熊南山,程斌.黃芪免疫藥理學研究進展[J].中國中醫(yī)藥雜志,2004,2(6):321-322.

[5] 劉穎.淺議當歸的化學成分與臨床藥理作用 [J].中國醫(yī)藥指南,2010,8(27):51-53.

[6] 李晶,付川,謝漢平.高滲鹽水點眼制作的小鼠干眼模型與評估[J].第三軍醫(yī)大學學報,2010,32(11):1183-1187.

[7] Pflugfelder SC,Jones D,Ji Z,Afonso A,et al.Altered cytokine balancein thetear fluid and conjunctivaof patientswith Sj?gren's syndrome kera-Toconjunctivitis sicca [J].Curr Eye Res,1999,19(3):201-211.

[8] Corrales RM,Stern ME,de Paiva CS,et al.Desiccatingstressstimulatesexpression of matrixmetalloproteinasesby the corneal epithelium[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,47(8):3293-3302.

[9] Chotikavanich S,de Paiva CS,LidQ,et al.Production and activity of matrix metall oproteinase-9 on the ocular surface increase in dysfunctional tear syndrome[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(7):3203-3209.

[10]Luo L,Li DQ,Pflugfelder SC.Hyper osmolarity-induced apoptosis in human corneal epithelial cells is mediated by cytochrome c and MAPK pathways[J].Cornea,2007,26(4):452-460.

[11]張月,亢澤峰,劉彥江,等.自擬益氣潤目湯治療干眼的臨床觀察[J].中國中醫(yī)眼科雜志,2014,24(2):105-107.