維生素B2和維生素B6補充對大鼠高尿酸血癥的影響

葛 冰，蔡 靜，鐘 鳳，馬愛國

(青島大學公共衛生學院/青島大學營養與健康研究院，山東青島 266021)

研究表明，高尿酸血癥與某些腎臟疾病[1-3]、心血管疾病[4]的發生發展亦存在聯系。維生素B2在體內是以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式與特定的蛋白形成黃素蛋白，而黃素蛋白又是機體許多酶系統的重要組成成分，參與機體許多重要的代謝反應。體內的維生素B6是以5’—磷酸吡哆醛(PLP)的形式參與多種代謝反應，與氨基酸代謝有密切關系[5]。B族維生素可以通過降低黃嘌呤氧化酶產生氧自由基及過氧化物的能力，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，從而減少尿酸的生成[6-7]；此外，維生素B2和維生素B6也可通過抑制同型半胱氨酸的水平從而達到降低尿酸的作用[6]，但其降低尿酸效果及機制仍待深入研究。因此，本實驗采用維生素B2、B6及B2和B6聯合干預，觀察維生素B2、維生素B6對大鼠高尿酸血癥的影響，并初步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑：氧嗪酸鉀，上海麥克林生化科技有限公司；酵母膏，北京奧博星生物技術有限責任公司；別嘌呤醇，世貿天階制藥有限公司；維生素B2片、維生素B6片，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司；黃嘌呤氧化酶(XOD)測試盒、腺苷脫氨酶(ADA)測試盒，南京建成生物工程研究所。

儀器設備：離心機、722分光光度計、全自動生化分析儀等。

1.2 實驗動物分組及處理

采用隨機數字表法將72只6w齡體質量為200±20g的雄性SD大鼠(購自山東省魯抗制藥有限公司，合格證為SCXK魯20140007)按體重分為6組，分別為空白對照組(C組)、氧嗪酸鉀模型組(HU組)、陽性對照 (AL)組、維生素B2(B2)組、維生素B6(B6)組、維生素B2+B6(BB)組，每組各12只。每6只大鼠同籠飼養，維持室溫在25℃左右。C組大鼠給予普通顆粒飼料喂養，飼料主要成分包括蛋白質(20%以上)、脂肪(4%)、粗纖維(5%)、灰分(8%)、水分(10%)等。其余各組給予質量分數20%酵母飼料喂養(將大鼠普通粉狀飼料中均勻加入酵母膏，最后將飼料重新制作成團狀)。除空白對照組外，其余各組大鼠給予1g/(kg·d·BW)氧嗪酸鉀灌胃；在此基礎上，AL組大鼠給予別嘌呤醇20mg/(kg·d·BW)，B2組大鼠給予1.18mg/(kg·d·BW)VitB2灌胃、B6組大鼠給予23.73mg/(kg·d·BW)VitB6灌胃、BB組大鼠給予1.18mg/(kg·d·BW)VitB2+23.73mg/(kg·d·BW)VitB6灌胃；灌胃體積均為5 mL/(kg·d·BW)，所有大鼠均自由飲水(自來水)和進食。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清尿酸(SUA)、尿素(Urea)、肌酐(SCr)等指標的測定 在干預的第0、4、12周，早晨8點，大鼠禁食12h后剪尾取血1.0～1.5mL。放置于室溫中，靜置凝血30min以上，在4℃條件下離心，以3 000r/min的轉速離心10min，再取300μL血清，使用全自動生化分析儀測定SUA水平。干預16w末，大鼠禁食12 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，留取血清，檢測SUA、Urea和SCr水平。

1.3.2 肝勻漿中黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶的檢測 干預16w末，大鼠禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，摘取各組大鼠新鮮肝臟組織制成10%肝勻漿。取100 μL 10%肝勻漿測定XOD活性，取50 μL肝均漿，測定ADA活性，具體操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 大鼠病理切片的制備 大鼠處死后，取出右側腎臟，縱向剖開放于固定液(10%中性福爾馬林)中固定>24 h以上用石蠟包埋。常規脫蠟后，制成3 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察細胞形態。

1.4 統計學處理

根據2×2析因設計方差分析設計實驗，納入分析的數據為HU組、B2組、B6組以及BB組的SUA、XOD及ADA等數據。對于交互作用，檢驗結果P<0.05，表明VitB2和VitB6之間存在交互作用。

2 結果與分析

2.1 各組大鼠SUA水平

如圖1所示，干預4w后，各組大鼠SUA水平均呈明顯上升趨勢，但無顯著差異。干預到第12w末，HU組大鼠SUA水平達到303.00 μmol/L，明顯高于其他各組(P<0.05)；而其余各組大鼠SUA水平與C組相比，差異并不明顯。干預16w末，HU組、B2組、B6組、BB組大鼠SUA水平分別達到了369.58、281.58、290.70、294.42 μmol/L，與C組相比顯著升高(P值均<0.05)。而與HU組相比，AL組、B2組、B6組、BB組大鼠血尿酸水平明顯降低(P值均<0.05)。說明維生素B2和維生素B6對高尿酸血癥大鼠SUA水平有明顯的改善作用。

圖1 各組大鼠SUA水平

2.2 各組大鼠Urea、SCr水平

如表1所示，與HU組相比，B2組、B6組、BB組大鼠Urea水平分別降低了20.14%、16.61%、16.47%(P值均<0.05)。SCr結果顯示，與C組相比，HU組明顯升高，而B2組、B6組、BB組降低(P值均<0.05)。與HU組相比，B2組、B6組、BB組大鼠SCr水平分別降低了23.98%、22.21%、21.56%(P值均<0.05)。

表1 各組大鼠Urea及SCr情況

注：a與C組相比，差異有統計學意義，P<0.05；b與HU組相比，差異有統計學意義，P<0.05；c與AL組相比，差異有統計學意義，P<0.05

2.3 各組大鼠腎臟病理切片結果

如圖2所示，C組、AL組、B6組大鼠腎臟結構正常，腎皮質中腎小球分布均勻，大小正常，腎小管無腫脹變性，無炎性細胞浸潤。而HU組、B2組、BB組大鼠的腎臟可見不同程度的炎性細胞浸潤，但無明顯纖維化。其中，HU組大鼠腎臟組織炎性細胞浸潤的程度最高。

圖2 各組大鼠腎臟病理改變(HE染色，200×)注：A：空白對照組(C組)；B：模型組(HU組，箭頭所指為炎性細胞)；C：陽性對照組(AL組)；D：維生素B2組(B2組，箭頭所指為炎性細胞)；E：維生素B6組(B6組)；F：維生素B2+B6組(BB組，箭頭所指為炎性細胞)

2.4 各組大鼠肝勻漿XOD、ADA活性

如表2所示，干預16w末，HU組、B6組、BB組大鼠肝勻漿XOD活力顯著高于C組(P值均<0.05)，分別達到了78.11、70.15、72.32 U/gprot。與HU組相比，其余各組大鼠肝勻漿XOD活力明顯降低(P值均<0.05)。與BB組相比，AL組和B2組大鼠肝勻漿XOD活力有明顯降低(P值均<0.05)。干預16w末，與C組相比，HU組大鼠肝勻漿ADA活力明顯升高(P<0.05)，達到了459.38 U/gprot；而其余各組與C組之間的差異并不明顯。與HU組相比，AL組、B2組和B6組大鼠肝勻漿ADA的活力明顯降低(P值均<0.05)。

2.5 維生素B2、維生素B6聯合作用分析

交互作用分析結果顯示，維生素B2與維生素B6對12w及16wSUA、XOD及ADA的影響不存在交互作用。因此，本實驗分析了VitB2和VitB6的主效應(表3)。結果顯示，VitB2(B2組與BB組)干預與非VitB2(B6組和HU組)干預相比，VitB2可以有效降低高尿酸血癥大鼠的SUA和肝臟XOD活性(P值均<0.05)，而對ADA的影響并不明顯。VitB6(B6組與BB組)干預與非VitB6(B2組和HU組)干預相比，VitB6僅對16w末大鼠SUA的水平有降低的作用，而對大鼠肝臟XOD和ADA活性無明顯的影響。

組別數量XODADAC1261.32±7.83338.74±77.39HU1278.10±5.69a459.38±75.42aAL1265.13±5.07bc361.48±106.70bB21265.29±4.48bc355.97±126.34bB61270.15±5.17ab385.00±90.33bBB1272.32±6.73ab405.94±63.00

注：a與C組相比，差異有統計學意義，P<0.05；b與HU組相比，差異有統計學意義，P<0.05；c與AL組相比，差異有統計學意義，P<0.05

表3 維生素B2與維生素B6對高尿酸血癥大鼠SUA、XOD、ADA析因設計分析結果

注：維生素B2干預包括B2組和BB組；維生素B6干預包括B6組和BB組

3 討論

本實驗采用酵母飼料喂養與氧嗪酸鉀灌胃建立大鼠高尿酸血癥模型[2，8-12]。攝入大劑量的酵母，可引起嘌呤代謝紊亂、黃嘌呤氧化酶活性增加，從而使尿酸的生成增加，產生高尿酸血癥[6]。氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑，可以抑制尿酸酶的活性，減少尿酸分解，從而造成血尿酸升高[13-14]。由于大鼠體內存在尿酸酶，因而選擇酵母與氧嗪酸鉀聯用來建立模型。

食物中攝入嘌呤過多、內源性嘌呤生成過多、嘌呤代謝速度增加均可引起尿酸生成過多。食物中50%的RNA、25%的DNA都最終要以尿酸的形式排泄[15]。酵母中含有大量的遺傳物質嘌呤，當攝入大量酵母時，嘌呤會經核苷酶分解為次黃嘌呤，后者經過黃嘌呤氧化酶(XOD)作用代謝為黃嘌呤，經進一步代謝最終形成大量尿酸[16-19]。研究表明，葉酸等B族維生素可以通過降低黃嘌呤氧化酶產生氧自由基及過氧化物的能力，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，從而同時減少了SUA生成[7，20-21]。維生素B2是以 FMN和FAD輔酶形式與蛋白質結合存在，參與機體許多代謝反應。FAD作為輔酶參與維生素B6轉變為磷酸吡哆醛的過程，而且維生素B2缺乏可引起亞甲基四氫葉酸還原酶的活性降低，引起葉酸代謝異常。因此，缺乏維生素B2可能會影響到黃嘌呤氧化酶的活性，從而影響機體尿酸水平。而本實驗顯示，B2組、B6組及BB組大鼠肝勻漿中XOD的活性較HU組明顯降低，證明補充維生素B2、維生素B6及兩者聯合應用，可以通過降低XOD活性，從而達到降低尿酸生成的效果。

腺苷脫氨酶(ADA)也是嘌呤核苷代謝中重要的酶類，其代謝終產物為尿酸[16-18]。本實驗顯示，B2、B6組大鼠肝勻漿中ADA的活性較HU組顯著降低，證明維生素B2、維生素B6可以通過降低ADA活性，從而達到降低血尿酸生成的效果。

尿素的濃度在一定程度上可反映腎小球濾過功能的損害程度，是常用的腎功能指標之一。臨床上檢測血肌酐是了解腎功能的主要方法之一，是腎臟功能的重要指標，血清肌酐升高意味著腎功能的損害[22]。本實驗中，HU組大鼠血清尿素及肌酐水平均升高，證明HU組大鼠的腎臟有一定程度的損傷，尿酸的排泄受到了一定的影響。而B2組、B6組及BB組大鼠Urea與SCr較HU組降低，提示維生素B2、維生素B6以及兩者聯合應用對高尿酸血癥大鼠的腎臟有一定的保護作用，從而影響其SUA的水平。從腎臟組織病理學結果也可以看出，HU組大鼠的炎性細胞浸潤程度最高，其腎臟的損傷程度較其他組嚴重。而B2組及BB組大鼠的浸潤程度較低，提示維生素B2可以改善高尿酸血癥大鼠的腎臟功能。

本實驗應用維生素B2、維生素B6以及維生素B2與B6聯合應用對高尿酸血癥大鼠進行干預，結果顯示，B2、B6組及BB組大鼠的SUA水平仍高于C組，與模型組相較，維生素B2、B6組及BB組血尿酸(SUA)水平明顯降低；但析因分析結果沒有顯示維生素B2和維生素B6之間對高尿酸血癥大鼠的SUA、XOD、ADA的交互作用；提示維生素B2、維生素B6對高尿酸血癥大鼠的SUA水平有一定的改善作用。鑒于該研究為動物實驗，維生素B2、B6對人群嘌呤代謝和尿酸水平影響以及對高尿酸血癥或痛風的預防和改善作用尚待進一步研究。◇

[1]鄭媛，王淳，李偉，等.復方痛風康對高尿酸血癥模型大鼠腎功能的保護作用及影響IL-1β、TNF-α、TGF-β_1的研究[J].中國中西醫結合腎病雜志，2015(7)：575-578.

[2]陳瞳，崔凌凌，王希波，等.高尿酸血癥大鼠模型的建立及其腎臟損傷觀察[J].山東醫藥，2013，53(43)：29-31.

[3]Hosoya T，et al.The effect of febuxostat to prevent a further reduction in renal function of patients with hyperuricemia who have never had gout and are complicated by chronic kidney disease stage 3：study protocol for a multicenter randomized controlled study[J]. Trials，2014，15(1)：26.

[4]Krishnan E，Pandya B J，Chung L，et al.Hyperuricemia and the risk for subclinical coronary atherosclerosis-data from a prospective observational cohort study[J]. Arthritis Research & Therapy，2011，13(2)：1-8.

[5]孫長顥.營養與食品衛生學[M]. 人民衛生出版社，2017.

[6]柳高，朱平.不同種類B族維生素和復方丹參滴丸對高尿酸血癥小鼠血尿酸水平的影響[D].北京：解放軍總醫院，2012.

[7]董靜.B族維生素在小鼠高尿酸血癥中的作用[D].北京：中國人民解放軍軍醫進修學院，2009.

[8]陳光亮，徐叔云.高尿酸血癥動物模型研究進展[J]. 中國藥理學通報，2004，20(4)：369-373.

[9]盧忠英，郁建平，朱夢琪，等.不同組合造模劑誘導大鼠高尿酸血癥模型的比較研究[J].山地農業生物學報，2014，33(5)：40-42.

[10]楊桂梅，黃勝華，李江，等.腺嘌呤和氧嗪酸制作高尿酸血癥大鼠模型比較[J].實驗動物科學，2011，28(2)：23-26.

[11]楊桂梅，黃勝華，連希艷，等.大鼠高尿酸血癥模型的建立[J].實驗動物科學，2011，28(3)：25-28.

[12]胡慶華，張憲，王鈺，等.芒果苷促進高尿酸血癥小鼠尿酸排泄和腎功能改善以及調節相關腎臟轉運體的作用[J]. 藥學學報，2010(10)：1239-1246.

[13]王凱，夏德萌，郝曉偉，等.氧嗪酸鉀誘導高尿酸血癥小鼠血清代謝組學研究[J]. 藥學服務與研究，2015，15(6)：416-421.

[14]Hall I H，Scoville J P，Reynolds D J，et al.Substituted cyclic imides as potential anti-gout agents[J]. Life Sciences，1990，46(26)：1923-1927.

[15]張慶燕，劉志紅.高尿酸血癥與腎臟損傷[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2009，18(3)：266-271.

[16]趙瑩，張啟虹，馮明聲，等.降尿酸藥物黃嘌呤氧化酶抑制劑的研究進展[J]. 藥學進展，2009，33(2)：55-61.

[17]Huang J，et al.Effects of genistein，apigenin，quercetin，rutin and astilbin on serum uric acid levels and xanthine oxidase activities in normal and hyperuricemic mice[J]. Food & Chemical Toxicology，2011，49(9)：1943-1947.

[18]趙永芳.葉黃素對高脂膳食SD大鼠血尿酸的影響及機制探討[D]. 鄭州：鄭州大學，2014.

[19]黃敬群，朱妙章，王四旺.染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁和落新婦苷對高尿酸血癥小鼠黃嘌呤氧化酶活性及血清尿酸水平的影響[J].中國藥理學通報，2011，27(4)：561-565.

[20]Wu C J，et al.Impact of adding folic acid，vitamin B(12)and probucol to standard antihypertensive medication on plasma homocysteine and asymmetric dimethylarginine levels of essential hypertension patients[J]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi，2012，40(12)：1003-1008.

[21]Verhaar M C，Wever R M，Kastelein J J，et al.5-methyltetrahydrofolate，the active form of folic acid，restores endothelial function in familial hypercholesterolemia[J]. Circulation，1998，97(3)：237-241.

[22]牛艷芬，高麗輝，劉旭，等.芒果苷對氧嗪酸鉀所致慢性高尿酸血癥大鼠尿酸及肝腎功能的影響[J]. 中國藥理學通報，2012，28(11)：1578-1581.