表沒食子兒茶素沒食子酸酯對黃曲霉毒素B1誘導大鼠急性肝損傷的抗氧化作用

趙靜芳 鄧志杰 肖德強 黃豐 高偉 張勇勝 潘劍 鄧祥發 魯力廣西醫科大學公共衛生學院，廣西高校高發疾病預防與控制研究重點實驗室（南寧500）；廣西醫科大學第一附屬醫院（南寧 500）；廣西醫科大學基礎醫學院（南寧500）

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是由廣泛存在于自然界中的黃曲霉和寄生曲霉所產生的一種毒素，其毒性是氰化物的10倍、砒霜的68倍，同時還具有致突變性、致畸性和致癌性。AFB1主要污染糧油及其制品，如花生、玉米、大米、棉籽、花生油、玉米油等。在高溫高濕地區，一些糧油及其制品在生長、收獲和儲存過程中較易被污染，對人類健康構成極大威脅［1］。目前我國AFB1污染問題仍舊十分嚴峻，如何減少或消除AFB1的攝入及對機體健康的影響，降低肝癌造成的危害成為難題。AFB1導致的肝癌屬于高度惡性腫瘤，病程短、進展快、治療難、易復發，如果僅依靠現有治療方法難以有效遏制癌細胞的蔓延，預防才是控制疾病最具成本效益的長期戰略。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是從綠茶中提取分離出的最有效的生物活性物質。隨著人們對它的深入研究，越來越多的證據表明EGCG具有抗氧化［2］、抗炎癥［3］、抗腫瘤［4-5］和保護免疫系統［6］、神經系統［7］及心腦血管系統［8］、緩解代謝綜合征［9］等方面的作用。EGCG在干預AFB1引起的肝損傷作用方面，目前國內外尚未見相關報道，具有廣闊的研究前景。本研究旨在探討EGCG抗AFB1致急性肝損傷的干預作用，同時為EGCG干預AFB1引起肝損傷提供臨床依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只SPF級雄性Sprague?Dawley（SD）大鼠，體質量180～220 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供（許可證號SCXK桂2014?0002）。實驗期間大鼠自由攝取食物（斯萊克普通標準飼料）和水，養殖環境12 h晝夜交替，溫度（23±1）℃，濕度（70±10）%。

1.2 主要試劑與儀器主要試劑AFB1（美國Sigma公司）；EGCG（成都普瑞法公司）；DMSO（法國MP公司）；過氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（SOD）、總谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Beckman Allegra X?15R離心機；日立7600?020全自動生化分析儀；life EVOS FL全自動熒光倒置顯微鏡；LEI?CA TP1020組織脫水機；LEICA EG1160組織包埋機；LEICA RM2235輪轉切片機；Thermo Multiskan全波長酶標讀數儀。

1.3 動物分組及處理 大鼠適應性飼養7 d后，隨機分為空白組、AFB1組、EGCG低劑量干預組（簡稱低E干預組）、EGCG高劑量干預組（簡稱高E干預組）以及EGCG組，每組10只。低E干預組灌胃25 mg/kg EGCG，高E干預組及EGCG組灌胃100 mg/kg EGCG，空白組及AFB1組則灌胃0.5 mL雙蒸水，每天1次，持續5 d。AFB1組、低E和高E干預組于第6天單劑量腹腔注射AFB12 mg/kg，空白組及EGCG組則予以等量雙蒸水腹腔注射，染毒后各組大鼠繼續以EGCG或雙蒸水繼續灌胃。所有大鼠于AFB1給藥48 h后稱量大鼠終體質量，腹腔注射1%苯巴比妥麻醉后打開腹腔腹主靜脈取血，取血后迅速移除肝臟并用預冷生理鹽水清洗后吸干稱重，剪肝大葉一塊約0.5 cm×0.5 cm×1 cm大小的組織浸泡在福爾馬林溶液中，充分固定后用于組織病理學研究，其余肝組織則用凍存管分裝后于液氮急凍，保存于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.4 指標與方法 臟器指數計算：肝指數（%）=肝濕質量/體質量×100%；脾指數（%）=脾濕質量/體質量×100%；腎指數（%）=腎濕質量/體質量×100%。血清肝功能指標的測定：所取血樣靜置約1 h，3 500 r/min、4℃離心10 min分離制備血清。用日立自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）含量。肝組織病理學檢驗（HE染色）：肝組織在福爾馬林溶液中充分固定后，經過脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、撈片、烤片、脫蠟、復水、蘇木素染色、洗脫、伊紅復染、清洗、晾片、封片一系列步驟后，通過光學顯微鏡觀察肝組織結構及其病理變化。肝組織抗氧化指標的測定：取適量肝臟組織，用電動勻漿機進行勻漿，按試劑盒說明書對CAT、GSH、SOD水平進行測定；取適量血清，按試劑盒說明書對MDA水平進行測定。

1.5 統計學方法 數據采用SPSS 19.0統計分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，分析前先檢查方差齊性，方差齊時采用最小顯著差法，方差不齊時采用Tamhane′s法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠存活及生長狀況 實驗期間各組大鼠均無死亡?？瞻捉M大鼠毛色正常、順滑有光澤，正常活動，精神狀態、食欲良好；AFB1組大鼠精神萎靡，毛色黯淡，活躍度及食欲有所下降；而EGCG干預組大鼠與AFB1組相比，生長狀況有不同程度的改善；EGCG組與空白組相比，沒有變化。

2.2 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠的體質量變化及臟器指數的影響 與空白組比較，EGCG組沒有變化，但AFB1組大鼠不僅體質量顯著降低（P＜0.05），而且肝、脾、腎指數明顯升高（P＜ 0.05）；與AFB1組比較，EGCG干預組體質量明顯升高，肝、脾、腎指數明顯降低（P＜0.05）；EGCG組與空白組相比，體質量、脾、腎指數沒有變化，見表1。

2.3 大鼠肝組織病理學變化（HE染色） 各組肝組織病理學HE染色代表圖見圖1。空白組大鼠的肝組織結構正常，肝小葉的構造完好清晰，肝細胞以中央門靜脈為核心呈放射狀整齊排列，肝細胞多呈多邊形，邊緣清晰，細胞核呈圓形，位于細胞中心，核仁清晰，胞質均勻；與空白組相比，AFB1組大鼠的肝小葉結構損傷嚴重，肝小葉內可見散在肝細胞點，同時出現了點片狀壞死，匯管區明顯增大且炎癥細胞浸潤嚴重，核大，有的可見雙核，細胞形態各異、大小不均；EGCG干預組的肝組織切片顯示，雖各劑量干預組均可見不同程度的病變，但其肝小葉結構都已基本恢復正常，肝細胞索排列規則，肝細胞變性及腫脹程度明顯減輕，匯管區炎癥浸潤明顯得到了抑制，低E干預組效果優于高E干預組；EGCG組相對于空白組沒有差異。由此可見，EGCG可以減輕AFB1所致大鼠的急性肝損傷，同時表明100 mg/kg EGCG對大鼠肝臟無影響。

表1 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠體質量及臟器指數影響Tab.1 Effect of EGCG on body weight and visceral index of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

表1 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠體質量及臟器指數影響Tab.1 Effect of EGCG on body weight and visceral index of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

注：與空白組比較，aP＜0.05；與AFB1組比較，bP＜0.05

組別空白組AFB1組低E干預組高E干預組EGCG組體質量244.90±11.69 225.60±13.72a 228.30±6.80a 236.3±14.01 242.3±3.83b肝指數0.029±0.001 0.033±0.002a 0.030±0.002b 0.029±0.002b 0.027±0.001ab脾指數0.002 1±0.000 4 0.002 6±0.000 4a 0.002 4±0.000 3a 0.002 2±0.000 4b 0.002 3±0.000 3腎指數0.007 5±0.000 5 0.008 5±0.000 7a 0.007 6±0.000 5b 0.007 5±0.000 3b 0.007 4±0.000 5b

圖1 EGCG抗AFB1致大鼠急性肝損傷作用的病理學觀察Fig.1 Pathological observation on the effect of EGCG on acute liver injury induced by AFB1in rats（HE staining，×200）

2.4 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠血清肝功能的影響 AFB1染毒后，大鼠肝功能指標ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP相較于空白組均有明顯升高（P＜0.05），而EGCG各劑量干預后可顯著降低AFB1對大鼠肝臟的損傷作用，其肝功能指標明顯好轉（與AFB1組相比，P＜0.05）。EGCG組與空白組比較，差異無統計學意義，見表2。

表2 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP的影響Tab.2 Effect of EGCG on serum ALT，AST，TBIL，DBIL and ALP in rats with acute liver injury induced by AFB1（n=10）±s

表2 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP的影響Tab.2 Effect of EGCG on serum ALT，AST，TBIL，DBIL and ALP in rats with acute liver injury induced by AFB1（n=10）±s

注:與空白組比較，aP＜0.05；與AFB1組比較，bP＜0.05

組別空白組AFB1組低E干預組高E干預組EGCG組ALT（U/L）53.80±6.91 4 184.00±364.53a 2 639.00±346.54ab 1 908.00±246.98ab 55.80±6.80b AST（U/L）111.10±10.38 5 422.20±265.70a 3 536.20±282.88ab 2 513.10±449.24ab 128.10±21.11b TBIL（μmol/L）2.27±0.34 33.75±3.41a 21.10±3.79ab 13.97±3.29ab 2.47±0.51b DBIL（μmol/L）0.68±0.18 20.55±2.36a 12.66±2.04ab 5.81±2.13ab 0.54±0.26b ALP（U/L）226.60±39.17 461.00±20.26a 321.30±33.56ab 282.80±35.18ab 277.20±60.49b

2.5 EGCG對AFB1所致急性肝損傷大鼠抗氧化能力的影響 AFB1染毒可致大鼠抗氧化能力明顯下降，與空白組相比其肝組織CAT、GSH、SOD水平降低（P＜0.05），血清MDA水平升高（P＜0.05）；EGCG干預后其抗氧化能力有所恢復，與AFB1組相比大鼠肝組織CAT、GSH、SOD水平增高（P＜0.05），血清MDA水平降低（P＜0.05）。EGCG組與空白組比較，差異無統計學意義，見表3。

表3 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠肝組織CAT、GSH、SOD及血清MDA水平的影響Tab.3 Effect of EGCG on SOD and MDA levels in liver tissue of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

表3 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠肝組織CAT、GSH、SOD及血清MDA水平的影響Tab.3 Effect of EGCG on SOD and MDA levels in liver tissue of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

注：與空白組比較，aP＜0.05；與AFB1組比較，bP＜0.05

組別空白組AFB1組低E干預組高E干預組EGCG組CAT（U/mg prot）82.44±4.34 48.55±11.06a 66.11±12.24ab 68.09±9.94ab 79.48±7.13b GSH（μmol/L）2 203.05±207.29 1 145.97±260.36a 1 495.49±213.60ab 1 712.04±159.34ab 2 421.03±294.74b SOD（U/mg prot）390.32±26.03 295.67±32.37a 362.15±49.86b 373.37±42.43b 395.36±56.92b血清MDA（nmol/mL）2.14±0.23 8.93±2.08a 4.90±2.56b 4.60±1.67ab 2.44±0.22b

3 討論

肝癌是世界上第6大最常見的癌癥，也是全世界癌癥死亡的3大主要原因之一［10］。據報道，我國每年約有38.3萬人死于肝癌，是全世界肝癌死亡病例數的51%，且發病和死亡水平居高不下，對居民生命健康危害極大，嚴峻的局勢給我國社會及醫療帶來了沉重的負擔［11］。流行病學研究表明，AFB1污染誘發的肝癌易發生于氣候炎熱潮濕的發展中國家，如東南亞地區以及撒哈拉以南的非洲地區；在我國則呈現出南高北低的現象。實驗研究證明，EGCG可從誘導凋亡、周期阻滯、信號傳導、抑制腫瘤侵襲等多方面多途徑多靶點地抑制腫瘤的增殖和轉移，從而安全有效地預防腫瘤發生。HAN等［12］的實驗通過EGCG在氧化應激作用機制下活化Nrf2信號通路，抑制了砷引起的肝臟病理損傷及氧化損傷，表明EGCG具有較好的預防化學性肝損傷作用。EGCG是從綠茶中提取的一種具備高效生物活性、無毒無害的化合物，是天然的自由基清除劑和抗氧化劑［13］，更是成為腫瘤預防藥物的安全選擇，且目前已廣泛應用于食品、醫藥、保健等領域。

研究證實ALT、AST是存在于肝細胞漿內的可溶性酶，當肝組織、肝細胞遭受損害時，細胞膜通透性增加，ALT、AST釋放入血，故血清ALT、AST水平的高低可反映肝細胞損傷程度［14］。在本實驗中，使用EGCG進行干預后的AFB1染毒大鼠，能夠有效降低血清中ALT、AST水平，這表明EGCG能夠起到干預AFB1所致肝損傷的作用。抗氧化防御系統包括內源性和外源性兩大部分，內源性防御系統主要包括SOD、CAT、血紅素加氧酶和非酶低分子量清除劑（如GSH），外源性防御系統為抗氧化劑，根據其來源可分為天然抗氧化劑（如類胡蘿卜素，飲食為主要來源），及由工業合成的合成抗氧化劑（如n?乙酰半胱氨酸），兩大系統的共同作用能夠維持或重建氧化還原穩態［15］。AFB1致肝損傷的發病機制與氧化應激密切相關，肝臟酶系在代謝過程中生成大量自由基，而這些自由基又可直接攻擊細胞中的蛋白質、DNA等，其中脂質過氧化是自由基介導損傷的主要表現之一，細胞抗氧化酶水平降低，引起機體氧化應激損傷［16-17］。MDA是脂質過氧化過程中的重要產物，它反映了體內脂質過氧化的氧化程度和細胞遭受自由基損傷的程度；SOD為最重要的抗氧化酶之一，有著防止細胞氧化損傷的作用；GSH、CAT能夠間接地反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度［18-19］。

本實驗降低了AFB1染毒大鼠血清MDA水平，同時提高了肝組織CAT、SOD和GSH水平，提示EGCG能夠起到干預AFB1所致肝損傷的作用，其機制可能為在內源性和外源性防御系統的共同作用下，提高了體內自由基清除劑水平及抗氧化酶的活性，阻止了脂質過氧化過程，從而影響膜流動性、破壞了膜蛋白，通過減少氧化應激保護了機體免受氧自由基的攻擊，但其具體分子作用機制尚需進一步研究。

本研究初步揭示了EGCG對AFB1致大鼠急性肝損傷的干預作用與機制，為今后對AFB1致（亞）慢性肝損傷和肝癌的干預研究奠定了基礎，也為今后預防AFB1肝損傷作用的膳食指導及其治療藥物的開發提供了理論依據。但本實驗研究對象為動物，所取標本為動物組織，與人體病理機制有一定差距，同時本實驗未從分子機制上深入探討，從而未能從多方面驗證EGCG干預AFB1所致肝損傷的效果。人體有效的臨床實驗研究及分子機制有待進行，方可進一步驗證EGCG對AFB1所致肝損傷的干預效果。

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